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Polymerase Chain Reaction（PCR）　聚合酶链式反应 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR基本原理 （1）模板 1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100?L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 （3）Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 ?l， 2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 循环参数 （3）延伸 68-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次 次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加 常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例) 模板 1.0 μL 上游引物 0.5 μL 下游引物 0.5 μL 10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.5 μL dNTPs 2.0 μL HiFi Taq酶 0.2-0.3 μL ddH2O 补足25 μL 共 25 μL 常用PCR反应条件 94℃ 2-5min 94℃ 30-40s Tm 30-45s 72℃ 1min/1kb 72℃ 10min 12℃ +∞ 几种常用PCR技术 RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 反向PCR (Reverse PCR) RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) RT-PCR基本原理 RT-PCR一般步骤 1、RNA提取 RT-PCR一般步骤 2、反转录 RT-PCR一般步骤 cDNA 末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一种基于PCR技术从低丰度的转录本中快速扩增cDNA 的5和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。 qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 SYBR Green 工作原理 融解曲线（dissociation curve） 基线（Baseline） 荧光阈值（threshold） 荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。 Ct值（ threshold value ） 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值。 研究表明，各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。 定量PCR的数学原理 荧光定量PCR的解析方法 相对定量 内参基因 内参基因：qRT-PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是管家基因，一般用β-actin，有时也用GAPDH。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。 内参基因的选择 理想的内参基因应该满足以下条件： 1、不存在假基因，以避免基因 DNA的扩增