生化反应工化程酶促反应动力学.pptVIP

* 由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。 * 戚以政，page 19. * * 注：第二个底物S与[SE]的亲合力与第一个底物S与E的亲合力是不一样的。 原理： 以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。 包埋法——格子型固定化酶 原理： 把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。 包埋法——微型胶囊法 特点： 微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。 与酶反应后的生成物被排除在微囊外， 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中， 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内。 包埋法——微型胶囊法 定义：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶的方法。 发生作用的氨基酸残基：： 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 N－末端的a－氨基 常用的双功能或多功能试剂：： 戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺 3.交联法制备固定化酶 固定化酶的制法及其特性比较 特性 制备方法 共价键 结合法 离子 结合法 物理 吸附法 包埋法 制备方法 难 易 易 难 酶活力 高 高 高 低 底物特异性 易变 不变 不变 不变 结合能力 强 中 弱 弱 再生 不可 可能 可能 不可 交联法 难 中 易变 强 不可 酶固定化后的性质变化 底物专一性的改变 稳定性增强 热稳定性、保存和使用稳定性。 最适pH值和最适温度变化 酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位受影响。 动力学参数的变化 固定化酶有利于实现酶促反应的连续化和自动控制。 固定化酶反应历程 微胶囊包埋法固定化酶为例 底物传递至载体外表面； 底物由外表面向内扩散； 酶促反应； 产物由内向外表面扩散； 产物传递到流体主体。 固定化酶的催化反应受两方面影响： 物质传递和酶促反应。 影响固定化酶促反应的主要因素 分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法） 位阻效应 微扰效应 分配效应 （可用Kp 定量描述） 分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。 Kp=Csi/Cso Kp的测定：已知底物浓度(CS)，体积(V0)的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cso)。 分配系数 (Kp) Csi:微环境的底物浓度； Cso:界面外的底物浓度。 影响固定化酶促反应的主要因素 分子构象的改变（常见于吸附法和共价偶联法） 位阻效应 微扰效应 分配效应 （可用Kp 定量描述） 扩散限制 （可定量描述） 水溶酶 本征动力学参数 本征速率和动力学参数 固定化酶 构象改变、位阻效应等 分配效应 固有速率和动力学参数 扩散限制 表观速率和动力学参数 本征速率：考虑到固定化后酶分子的结构改变，底物作用及位阻效应等诸因素后，固定化酶的反应速率称为本征速率。 固有速率：假定底物和产物在酶的微环境及宏观环境之间的传递是无限迅速，也就是在没有扩散阻力情况下的反应速率。 不同反应速率与参数及其相互关系 2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析 2.3.2.1 外部扩散过程 ——以表面固定化酶为例 底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率: 式中 V d——底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率，（mol/L· s）; kL——液膜传质系数； a ——传质比表面积； [S]——液相主体的底物浓度,(mol/L)； [S]S——固定化酶表面处底物浓度,(mol/L)。 在载体外表面的酶促反应符合M-M方程： 式中 VS ——载体外表面的底物消耗速率，(mol/L· s); [S]S——载体外表面的底物浓度(mol/L)。 在稳定的状态下有: 当外扩散速率很快时，此时无外扩散的限制: VS0为在外扩散速率很快时的最大的反应速率。 当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，此时: Vd为在外扩散速率很慢时的最大的传质速率。 当[S] 较低时，VS0＞ Vd为外扩散限制，此时