2018年达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案.docVIP

达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案 　　小鼠淋巴细胞分离液说明书 　　Cat#:DKW33-R0100 　　本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为Iodixanol，分子量为1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 　　EZ-Sep?Mouse1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。 　　本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT检测结果同其它组完全一致。 　　产品信息： 　　商品名：EZ-Sep?Mouse1×（英文） 　　易得小鼠淋巴细胞分离液（中文） 　　规密 　　格：100mL/瓶 　　度：1.0810±0.0005g/mL(20oC) 　　内毒素：≤0.5EU/mL 　　适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 　　分离大鼠/兔子血液中的PBMC 　　保存方法：4oC避光保存，保持无菌保质期：12个月 　　渗透压：280±15mOsm 　　主要成份：Iodixanol，化学惰性，无生物毒性 　　使用方法： 　　自备材料：35mm培养皿、10mL玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁 　　成90mm×90mm正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 　　实验步骤：1.2.3.4.5.6.7. 　　断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 　　在35mm培养皿中放入4-5mLEZ-Sep?Mouse1×淋巴细胞分离液（取用前摇匀）。研磨（研磨操作请参考图二）。 　　把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖200-500uL的1640培养基（保持液面分界明显）。 　　室温，800g离心30min。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 　　吸出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞。 　　倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。 　　注意： 　　? 　　若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠 　　分离液等体积稀释并混匀后，再进行第4步操作。分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在5min以内。? 　　大鼠脾脏淋巴细胞分离操作： 　　因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离操作完全相同。? 　　大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作：1.2. 　　新鲜抽取的大鼠/兔子抗凝外周血2-4mL用1640稀释一倍（血液稀释后分离效果更佳，注意无菌操作）。在15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面上层，避免两种液体界面混合。3.4. 　　室温，800g离心15~20min。设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，设为第三档）。后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。 　　特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法： 　　??? 　　推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。 　　关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度。将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。注意：1. 　　控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡。 　　2.3. 　　平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹力。 　　镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑动。 　　参考文献： 　　1.2.3.4.5.6.7.8. 　　殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 　　JuntaoZou,et,al.[J]JournaloftheNeurologicalSciences,2008,5:003-007朱鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049朱鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294刘义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694张慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101王晓莲, 　　等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242 　　丁隆,等.[J]第三军医大学学报,2007,29(11):1072-107510.夏婷,等.[J]中国实验血液学杂志