药学本科《生物化学》实验12dna的限制性内切酶酶切分析.pptVIP

5.电泳：稳压条件下100V电泳， 约30min. 6.观察结果：紫外分析仪上观察，DNA存在处显绿色荧光条带 ，观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。 思考题： DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请说明原因。 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前两个实验，分析可能的原因 值日生要求 检查全班的所有移液枪是否调好、把全班的试剂整理好、清理好垃圾，拖一遍地、整理好讲台，该交还给实验室老师的试剂请送到对面的427房 * * DNA 的限制性内切酶酶切分析 实验十二 限制性内切酶(Restriction Endonuclease,RE): 由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，产生粘性末端或平头末端 实验原理 EcoR I的作用模式图: 产生5 ?突出粘性末端 **********GAATTC******** **********CTTAAG******** 5? 3? 5? 3? EcoR I ********G ********CTTAA 5? 3? －OH － P －AATTC******* G******* 3? 5? P OH－ 5? 5? EcoR I Bcl-2 (1.9kb) pBS (2.96kb) pBS-Bcl-2 (4.86kb) Bcl-2重组质粒的酶切模式图 1.酶切: 20μl反应体系 组分 加入体积 灭菌双蒸水 5μl 10×buffer H 2μl 质粒DNA 10μl 20U/μl EcoRI 3μl 操作步骤（改动） 盖紧盖，掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h 在做酶切之前，一定要将上次的质粒DNA沉淀溶解完全之后，再做今天的实验！！！ 3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，加入核酸染料5μl ，混匀，将胶缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。 2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液60ml，微波炉加热中火，2min，摇匀，至无颗粒。（每班叫一位同学制胶） 4.点样： ① （学生）4μl的6×载样buffer 加入酶切反应后的EP管混匀，吸20μl混合物 ②（老师示范点样） 10μl DNA Marker。 (点样孔置负极端） DNA Marker 已酶切质粒 未酶切质粒 750bp 500bp 100bp 2.96kb 1.9 kb 点样孔 250bp 1000bp 2000bp 电泳结果 注意事项 1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部! 2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败。 3.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破。 4.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔中有无气泡，电泳前正确连接正负极。 5.电泳时电压不超过5V/cm胶长。 6.凡是用在酶切反应中的Tip尖、离心管、 蒸馏水都要灭菌。每次取溶液应使用新的 Tip尖，避免污染。 1. DNA中的DNase、蛋白、RNA、 SDS 、EDTA、酚、氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果。 2. DNA中的杂DNA、蛋白可与RE非专一性结合使酶活性降低，另外杂DNA 也竞争酶的切口，往往造成切不动。 3. DNA中的盐离子（如Mn2+、Cu2+、Co2+和Zn2+等）与有机溶剂（如酚、氯仿和乙醇等）都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性)。 各组卫生要求 把自己所在的桌面擦一遍、排列好桌面的试剂、往枪盒里装满枪尖（枪尖在电泳仪前面抽屉）、调好移液枪、倒掉废液缸的垃圾。