工具酶与基因工程powerpoint演示文稿.pptxVIP

第一部分 工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1．限制性核酸内切酶的发现 2．I类和III类限制和修饰酶的基本特征 3．II类限制和修饰酶的基本特征 4．甲基化酶的基本特征 二．其它工具酶 1． DNA连接酶 2．聚合酶 3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 4. SI核酸酶 5．Bal31核酸酶 6．碱性磷酸单脂酶 ;限制性内切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.? 一．限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用) 宿主细胞的限制和修饰作用： 两种不同来源的入-噬菌体 入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株. ;;1;; 二．限制和修饰作用的分子机制 1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。 1）?它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）?hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3）?hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。 4）? hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。 ; 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA 特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰） 3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ----------（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰??同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.) ;6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌体可以感染C株，而在 C株繁殖入- 噬菌体则在 K株和 B 株 受到严格的限制作用 三 ．限制性内切酶的分类：（三大类） I． I类， II类, III类. 2． I类，III类为限制---修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在 同一酶分子中。 3 ． II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点 专 一，适合于DNA重组。;四．原核细胞中限制和修饰系统; 五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔 1）I类酶，EcoK，EcoB。 （1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。 （2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S—腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。 （3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制, 或限修饰，或不限制不限修饰 ;;2）III类限制修饰酶基本特怔 （1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。 （3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’ ;3）II类限制修饰酶基本特怔 （1） 命名规则： 生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称 + 菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序） Hid III