免疫荧光技术-厦门大学生命科学国家级实验教学示范中心.pptVIP

免疫荧光技术和细胞骨架的染色与观察 厦门大学生命科学学院 实验目的与要求 1. 掌握免疫荧光技术的基本原理及其应用； 2. 掌握荧光显微镜的成像基本原理及其应用。 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。  该技术的主要优缺点 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，结果判定的客观性不足， 技术程序也还比较复杂。 抗原是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原。 前一种性能称为免疫原性或抗原性，后一种性能称为反应原性或免疫反应性。 抗原的概念 环境中的大部分生物（包括病原生物）及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染和其它的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。 同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。 抗体 实验的基本原理 抗原抗体反应：抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。 荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 直接法 间接法 补体法 其他 直接法 将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检 操作简便、特异性高、非特异性染色少 敏感性低 抗原 标记抗体 荧光 间接法 先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检 未知抗原 未标记抗体 标记抗体 荧光 补体法 利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光 补体 标记抗补体抗体 荧光素的特性 一抗：鼠抗人a-tubulin单克隆抗体，用时稀释5000倍。 二抗：羊抗鼠免疫球蛋白（荧光素555标记），用时稀释2000倍。 一抗稀释液：1ml PBS中5%牛血清白蛋白（BSA），溶解后加入TritonX-100（终浓度0.05%）。 二抗稀释液：配法同一抗。 抗体准备 实验步骤 细胞固定 细胞前处理 封闭 一抗孵育 二抗孵育 漂洗 漂洗 制片观察 细胞固定 封闭 实验步骤的主要原理及作用 多聚甲醛固定， 抗原恢复 细胞固定的目的： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。 细胞固定的常用试剂： （1）醛类，如4%多聚甲醛 （2）醇类，如甲醇，乙醇 （3）酮类，如丙酮 细胞前处理 材料准备 24孔细胞培养板 （分别用于第一抗体和第二抗体的孵育）；封口膜 （修剪成适宜大小）； 镊子；加样枪；纸巾；盖玻片； 铝箔纸 细胞爬片， 已经固定 ①对照，仅孵育第二抗体 ②样品，孵育第一及第二抗体 选取两个培养孔，分别置入一片细胞爬片，细胞向上 封口膜修剪成如左大小的小圆片，以能 放入细胞培养板的小孔为准。 人工湿盒 蒸馏水湿润的纸巾，粘贴在24孔培养板盖子内侧， 在抗体孵育和漂洗过程中盖上盖子，保持样品湿润。 实验步骤 镊子取长有人宫颈癌上皮细胞 （HeLa）细胞的载玻片，冷甲醇-200C固定3 min（已完成), 置于24孔细胞培养培养平板的小孔中，细胞面向上）。 PBS中漂洗3次，每次2分钟； 于含0.2%TritonX-100的PBS中室温透化10 min; 滴加100 ul 封闭液（PBS+ 5％BSA，0.05% TritonX-100） 室温封闭20 min; 0.05% Triton X-100 PBS（漂洗2次，每次5 min）; 移出封闭液，滴加50 ul一抗（已经稀释，请老师帮助添加）至细胞表面，将封口膜修剪成合适的小圆片，用镊子夹持，覆盖在细胞爬片的表面，于室温孵育60 mins. 0.05% Triton X-100-PBS 漂洗5次，每次5 min; 滴加荧光素标记的二抗（已经稀释，请老师帮忙添加）50 ul，同样覆盖修