生物技术概论基因工程.ppt

学习要求 掌握基因工程的概念,DNA重组原理与技术; 熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径; 了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。 第一节 基因工程概述 一、复习DNA、基因的概念和结构 1. DNA的组成、结构和功能 2、基因的概念和结构 基因是编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是具有遗传信息一段DNA序列。 结构：包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。 3、 基因工程的概念 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。 体外DNA重组是基因工程的基本内容和关键技术。 自然界的DNA重组----难以预测 基因工程----按人的意志进行DNA重组 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称分子克隆技术。 因此供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 二、基因工程诞生的基础 （一）理论上的三大发现 1、40年代确定的遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质（肺炎双球菌实验） 2、50年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。 3、50年代末－60年代：确定了遗传信息的传递方式(密码子学说，中心法则) 4、多肽与基因之间存在对应关系 5、遗传密码是通用的 6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能 （三）技术上的三大发明 1、60年代末－70年代：限制性核酸内切酶的发现 2、70年代： DNA连接酶的发现 3、70年代：基因工程载体的使用。 1973年第一次实现了重组转化成功的例子。从此基因工程诞生，这年定为基因工程诞生的元年。 三、基因工程操作的技术路线 第二节 基因工程四大要素 工具酶 载体 目的基因 受体 一、工具酶 （一）限制性内切核酸酶 1、概念 由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。 2、限制性内切核酸酶识别序列 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧； 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。 同裂酶：识别相同序列的限制酶 同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以具有相同的酶切位点。前者肯定是两种不同的限制性内切核酸酶，而后者往往是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶。 同尾酶 (isocaudamer) 与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 EcoRI等酶切产生的5‘粘性末端 PstI等酶切产生的3’粘性末端 PvuII等酶切产生的平末端 4、限制性内切核酸酶反应系统 反应底物 内切酶 反应缓冲液 适当的温度 5、酶切方法 双酶切法 两种不同的酶切割同一种DNA分子的方法。 （１）分别酶切 （２）同时酶切 先后加入酶：适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度的酶。 同时加入酶：适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加入反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸内切酶完全切割后，升温到第二种酶的最适反应温度完成第二种酶的完全切割。 完全消化（完全酶切）：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 部分酶切法（不完全酶切）：只有有限数量的酶切位点被切开。 部分酶切的原因： 底物DNA的纯度低； 识别序列的甲基化； 酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜； 反应时间不足等。 （若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。） 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性