基因工四程技术在改进微生物菌种方面的应用.ppt

基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 (一) 提高次级代谢产物的产量 1. 增加限速酶的基因拷贝数 异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响 增加IPNS基因提高青霉素产量 例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶 增加限速酶基因提高头孢菌素C产量 增加限速酶的其它例子-3: 增加限速酶的其它例子-4: 2.增加正调节基因, 去除负调节基因 调节基因在次级代谢产物合成中的作用 去除负调节基因使结构基因超量表达 3.增加抗性基因的拷贝数 增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量 卡那霉素6’-乙酰转移酶[AAC（6’）] 的作用 增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量-2 例一: 阿维菌素产生菌的基因改造 阿维菌素“B”组分转化成“A”组分的分子基础 阿维菌素C5位的甲基化 1.用基因工程手段灭活C5-氧甲基转移酶基因 Disruption plasmid of aveD gene 双交换菌株（阻断变株）的挑选 发酵产物的HPLC分析 D24-1组分的质谱分析 2. 只产Avermectin “2”组分基因工程菌的构建 aveC基因在染色体上的位置 重组质粒的构建 重组质粒的转化 Gene replacement (基因置换） 遗传型的改变 基因工程菌AveC-9发酵产物的HPLC分析 例二. 黑暗链霉菌的基因改造 黑暗链霉菌（S.tenebrarius）菌株U-135产生的两种主要抗生素 妥布霉素(Tobramycin) 安普霉素(Apramycin) A brief introduction to apramycin 安普霉素/妥布霉素生物合成基因簇的位置 (三) 改进菌种的生理性能 (四) 产生新的代谢产物 SS B am aveC am aveC tsrR amR aveC– tsrS amR aveC – 传几代后，丢掉质粒 基因工程菌AveC9 黑暗链霉菌首先是从墨西哥土壤中分离得到的， 1967由美国礼莱公司（Eli Lilly Co.）最初报道了黑暗链霉菌产生的代谢产物-尼拉霉素复合物，它包括1、1’、2、3、4、5、5’、6、7等15个组分。其中组分2、4、5’为尼拉霉素的主组分，其他组分为小组分。组分2为安普霉素（Apramycin），组分4为6”-O-氨甲酰卡那霉素B（6”-O-Carbamoylkanamycin B，CKB），组分5’为6”-O-氨甲酰托普霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）[3] 七八十年代，我国中科院微生物所与四川抗生素工业研究所先后分离到黑暗链霉菌的新菌株：黑暗链霉菌410[7]与黑暗链霉菌83-1050B[8]，它们的组分中含有尼拉霉素组分2、4、5’。经过“七五”攻关中筛选到了只产组分2（Apramycin）、5’ （6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）的菌株U-135[9]。 妥布霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份5’ 。它对革兰式阴性菌有很高的抗菌活性。特别是对绿脓杆菌有独特的抗菌作用，因此常用来治疗烧伤后的绿脓杆菌感染。 临床上使用的妥布霉素是由黑暗链霉菌经过发酵后， 经过树脂吸附，层析后得到中间产物6”-O-氨甲酰托普霉素，然后再将6”-甲酰基水解掉，得到妥布霉素。 安普霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份2 。它对革兰式阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌仍有抑制和杀灭作用，与常用的氨基糖苷类抗生素不易产生交叉耐药性。80年代在美国和欧洲安普霉素作为兽用抗生素和饲料添加剂投入市场。我们课题组经过九五攻关，获得了产生安普霉素单一组分的菌株，并把它开发成为二类兽用新药和饲料添加剂。 安普霉素生物合成基因簇部分基因 妥布霉素生物合成基因簇？ ？ aprA aprR 1.通过鸟枪克隆法从黑暗链霉菌H-6中克隆到了安普霉素抗性基因aprR 2.在抗基因上游找到一个完整的ORF,定名为aprA。 3.将抗性基因上游片段和报告基因ermE, xylE插入到带有aprA片段的质粒。 pHZ132中, 得到重组质粒。 4. 转化黑暗链霉菌得到双交换的菌株42#菌株。 5.对42#菌株发酵产物的分析表明,只产生单一的组分6”-O-氨甲酰托普霉素。