《分子生物学绪论》-课件设计（公开）.pptVIP

谢谢！ * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口 粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 当一个DNA分子含有6个拷贝的 GAATTC: 它将被酶切成7个片段，可用凝胶电泳方法将其分离。 (The largest fragment) (The smallest fragment) 采用几种限制性内切酶组合可以使DNA分子产生特定的片段. e.g. EcoRI + HindIII DNA连接酶(DNA ligase ) 1967年在三个实验室同时发现的。 活性：封闭DNA链上缺口，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。 要求：这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 DNA连接酶的作用机制 细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 2.2 基因运载工具—DNA载体的使用 染色体外的遗传因子 细菌的性因子— F 因子 Lederberg 1946 抗药性因子（R ） 大肠杆菌素因子（COE） 质粒 Cohen 1973 基因载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 6×His λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他载体 2.3 逆转录酶的发现 逆转录病毒最早于1911年由Rous从鸡肉瘤组织中分离。 1970年Baltimore和Temin发现逆转录病毒颗粒中带有逆转录酶，复制是通过DNA中间阶段，病毒DNA可整合于宿主细胞。这一发现改变了传统的分子生物学关于DNA ? RNA ? 蛋白质的概念,因而获得Nobel Prize。 分子生物学的研究内容 DNA重组技术 基因表达调控研究 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 基因组、功能基因组与生物信息学研究 DNA重组技术（又称基因工程） 将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定细胞中复制、表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状 DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，限制性内切酶、DNA连接酶及其它工具酶发现与应用则是这一技术得以建立的关键。 Cohen等首次进行的DNA体外重组 PSC101 R6-3： 质粒 Ner： 抗新霉素基因 Sr ： 抗黄胺基因 Tcr： 抗四环素基因 Sr Sr Ner Tcr Psc101