利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母-中国管理科学.PDF

Hereditas (Beijing) 2014 年 10 月, 36(10): 1053―1061 研究报告 利用可重复使用的URA3 标记基因建立热带假丝酵母基 因敲除系统 1 1 1 1 1 2 项峥 ，陈献忠 ，张利华 ，沈微 ，樊游 ，陆茂林 1. 江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122 ； 2. 江苏省微生物研究所有限责任公司，无锡 214063 摘要:热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力，但二倍体遗传结构和较低的遗传 转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造 热带假丝酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336 为出发菌株，通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷 型突变株C. tropicalis XZX(ura3/ura3) 。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase ，PDC)基因作为靶基因构建了 两端包含同源臂并在选择性标记C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase ，乳清酸核苷-5-磷酸脱 羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 的hisG 序列的基因敲除盒PDC1-hisG- URA3-hisG- PDC1 (PHUHP) ，并转化宿主菌株C. tropicalis XZX ，筛选获得PHUHP 片段正确整合到染色体的PDC 基因位点 的转化子XZX02 。在此基础上，将转化子 XZX02 涂布于 5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上，筛选得到 URA3 基因从PHUHP 片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03 。进一步构建了第2 个PDC 等位基因的删除表达盒PDCm- URA3-PDCm ，并转化C. tropicalis XZX03 菌株，获得转化子C. tropicalis XZX04 。经PCR 和DNA 测序确认转 化子C. tropicalis XZX04 细胞染色体上的两个PDC 等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可 重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术，利用该技术成功敲除了细胞的 PDC 基因，为进一步利用代谢工程改 造热带假丝酵母奠定了基础。 关键词:热带假丝酵母；遗传转化；同源重组；URA3 基因；基因敲除 Development of a genetic transformation system for Candida tropicalis based on a reusable selection marker of URA3 gene 1 1 1 1 1 2 Zheng Xiang , Xianzhong Chen , Lihua Zhang , Wei Shen , You Fan , Maolin Lu 1. Key Lab of Industrial Biotechnology , Education Ministry , School of Biotechnology, Jiangnan University , Wuxi 214122, China; 2. Jiangsu Institute of Microbiology Co. Ltd. , Wuxi 214063, China Abstract: Candida tropicalis, a diploid asporogenic yeast, is frequently utilized in industrial applications and 收稿日期: 2014−04−11; 修回日期: 2014−06−10 基金项目: 江苏省科技支撑计划项目(编号：BE2012618)资助 作者简介:项峥，硕士研究生，专业方向：微生物遗传育种。E-mail: wq5513031@126.com 通讯作者: 陈献忠，博士，副教授，研究方向：微生物遗传育种与代谢工程。