血浆循环Mi发croRNA提取检测及其在冠心病的表达.pptVIP

血浆循环MicroRNA提取检测及其在冠心病的表达 讲述目录 研究背景 MicroRNA是生物体内长度约为20－23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行调控。 最近研究发现血液循环中也存在miRNA，有希望作为疾病无创诊断或者疾病预后的生物标志物。 Solexa Whole Genome Sequencing 我们的研究工作 血浆循环miRNA提取方法 二、miRNA提取方法学的考察（一） 1、采用外源合成的cel-miRNA-39检验提取方法的提取效率： 四、本文结论： 结论：采用Trizol LS提取血浆总RNA的方法可行，miRNA检测方法的特异性和灵敏性较好，血浆hsa-miR-126表达的差异可能在冠心病的发展过程中发挥调节作用，其作用机制可能与影响血管生成和心肌保护作用有关，具体的机制还有待于进一步的研究。 郑志伟 劳海燕 余细勇 林秋雄 朱杰宁 王玲 孙硕 陈纪言 钟诗龙△ 广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所 背景 方法 检测 探讨 简述血浆循环miRNA提取检测的方法 采用前述建立的方法，在25例冠心病患者和30例健康对照中检测miRNA的表达情况。 在细胞实验进一步探讨miRNA的作用机制 miRNAs (21-23nt) were most abundant sequences in serum RNAs Chen et al. 2008 Cell Res. miRNA差异？ 疾病 预后，转归 血浆循环miRNA的表达 – 预测?生物标记物？ 我们的设想 研究血浆中存在的循环miRNA，建立其提取检测的方法，并且检测血浆miRNA在冠心病人中的表达情况，寻找疾病发生发展或者影响预后的生物标记物。 血浆miRNA提取检测基本流程 血浆miRNA 的提取 第四步 晾干，加无RNAase水进行溶解，检测浓度，保存 第一步 ProteinK 消化，Trizol LS和氯仿对血浆进行提取 第三步 离心，取得RNA沉淀，70%乙醇洗涤 第二步 异丙醇和核酸共沉淀剂对前述水相进行沉淀 血浆循环miRNA的检测原理 实验结果 2、has-miR-16的累加实验 采用加入外源合成的has-miR-16 mimics，比较提取方法的有效性。 二、miRNA提取方法学的考察（二） 内源 B mimics A 三、检测miRNA在两组人群中的表达差异 Coronary artery heart disease （CHD） 25例 Healthy contron 30例 3.1、研究的一般资料—年龄 3.2、研究的一般资料—性别 P=0.155 3.3、血浆循环has-miR-126的表达量 3.4、血浆循环has-miR-16的表达量 四、进一步的机制探讨 1、培养人心肌细胞AC16，进行miR-126 inhibitor 的转染，Q-PCR检测miR-126和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。 2、Tunel 检测心肌细胞凋 亡情况。 四、Q-PCR检测VEGF的表达结果 VEGF有促进血管生成的作用，在冠心病患者中miR-126的表达下降，可能跟VEGF调节血管生成有关，其具体的机制还有待进一步的研究。 三、TUNEL凋亡结果分析（一） 图 1 AC16 细胞-正常 A：细胞形态；B：Tunel；C:DAPI 染色（核定位）； D：B 和 C 的重叠图 三、TUNEL凋亡结果分析（二） 图 3 AC16 细胞转染 mir-126 inhibitor A：细胞形态； B：Tunel； C:DAPI 染色（核定位）； D：B 和 C 的重叠图