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核酸定量检测技术 温州医学院检验医学院 温州医学院附属第一医院检验科 陶志华 分子杂交定量分析技术 （二） 双抗体夹心杂交法 英国Murex Diagnostics Ltd发明, 称之为Digene系统。 该技术采用两种抗DNA/RNA杂交体的抗体：一抗为捕获抗体，直接吸附在微孔反应板上，二抗是偶联了AP的标记抗体，通过酶促化学发光反应检测DNA/RNA杂交体的信号。真正的核酸探针是RNA，它能特异地与HBV DNA基因组负链互补。??? PCR基因定量技术 Yn=Yn-1*(1+Ev)  0 = Ev =1Yn=X*(1+Ev)n LgY=LgX + n × Lg(1+E)LgX = LgY - n × Lg(1+E) 决定扩增效率（E)的因素： 反应体系方面： 反应最佳条件、反应物的相对含量、循环次数 反应管之间： 扩增仪上不同位置 标本之间： 不同标本中所含有的DNA聚合酶的抑制剂 引物和模板的结合能力 模板的含量 怎么办？ 摸索最佳的实验条件 严格实验室规范化管理 制定规范化的操作规程 采用内标法 （二） 定量PCR的方法学分类: 外标法 非竞争内标定量PCR 内标法 竞争定量PCR 构建内标物应具备: 与靶基因待分析序列比较: 相同的引物结合位点 相同的长度 相似的碱基排列顺序 或G+C%含量相似 不同的探针结合位点 内标法准确定量的原理： YS n=XS*(1+ES)n YI n=XI *(1+EI)n YS n XS YI n XI 内标物的构建: 靶基因扩增产物的突变 限制性片段的插入或缺失 含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列 （三）PCR产物的检测与定量 终点检测法 琼脂电泳扫描检测法 固相捕获法 非探针杂交捕获法 探针杂交捕获法 HPLC检测法 实时检测法 Taqman技术 LightCycler技术 (一)分支链DNA信号放大技术 （bDNA) 美国Chiron公司, 分别以微反应板和琼脂糖珠为载体，在定量检测系统中，采用了一种人工合成的、结构如同树枝的DNA信号放大探针，分支链DNA（branched DNA）因此而得名。???? PCR扩增循环过程 （一）PCR基因定量基础 ELISA-PCR技术 一. 荧 光 染 料 Fam(495nm) Tamra(560nm) L640 Tet (520nm) Hex(537nm) L705 Tamra/Fam Tamra/Tet Tamra/Hex 光能 热能 转移给临近的分子 荧光定量PCR技术 荧光共振能量转移(FRET) 荧光标记信号的产生 荧光标记探针 动态监测荧光信号变化 二.荧光PCR类型 特异性荧光探针 Taqman双荧光标记探针 molecular Beacon荧光标记探针 荧光标记杂交双探针 特异性荧光双标记探针 Taq酶 5’→3’外切酶活性 Molecular beacon 荧光标记杂交双探针 变性 退火 延伸 结束 三. 荧光实时定量PCR的定量原理： Y=X×(1+E)n LgY=LgX + n × Lg(1+E) LgX = LgY - n × Lg(1+E) n = LgY/ Lg(1+E) – 1/ Lg(1+E) × LgX