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 细胞表型实验介绍 2018 2018年8月30日 目录 研究内容目的与意义 实验原理 实验过程 结果分析 www.islide.cc 「 让PPT设计简单起来！」 2 细胞表型实验 定义：由基因型所产生的细胞的物理表观和可观察到的性质。 研究主要内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、趋化、增殖、生长等。 细胞表型分析目的意义： 检测细胞的表型，可以帮助了解相关基因、蛋白、药物的机理，是科学研究不可或缺的手段。 3 1.细胞凋亡、周期 细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。依次经过G1-S-G2/M，不同时期的细胞内部经历精确的调控，反应相应的机理。研究细胞周期的变化，有利于了解基因、蛋白、药物对细胞周期产生的影响，进而指导科研工作。 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 4 流式细胞术 5 1定义：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 2.特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。 BD-Calibur BD FACSVantage 流式细胞作用机制 6 分析系统 光学系统 液流系统 检测系统 流式细胞仪可检测到的细胞参数 7 非荧光信号 前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性 颗粒度 细胞大小 荧光信号 8 荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。 有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱） 一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3。 荧光信号与细胞特性 9 荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量 10 流式结果分析 11 散点图 密度图 二维等高图 报告中常见的几种流式细胞图 直方图 细胞周期 12 流式细胞仪PI染色法检测细胞周期 细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测。 细胞培养 细胞周期同步 细胞加药 细胞固定 PI染色 流式上机 数据分析 PI：碘化丙啶 13 细胞凋亡 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 UL：上左区；一般认为是死亡细胞, UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞, LL：下左区； 正常阴性细胞, LR：下右区; 早期凋亡细胞, ps:磷脂酰丝氨酸 Annexin-V:Ca2+依赖性磷脂结合蛋白 2.细胞迁移 划痕实验:细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。 14 ① 15 ② ③ ④ 3.细胞侵袭 细胞侵袭:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，肿瘤细胞在侵袭能力较强的情况下，会分泌相关酶类消化基质胶，从而从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。 16 Transwell 17 这是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层的一张有通透性的膜，这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 细胞侵袭 18 实验实例：孵育24h 4.细胞增殖（克隆形成） 19 单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力强弱。细胞培养环境的改变或药物、基因等外源性因素的作用能导致细胞克隆形成能力以及细胞集落的大小发生改变。 细胞感染 克隆形成 细胞固定 细胞染色 克隆计数 5.细胞生长（MTT法） MTT法原理 MTT比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。 在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 MTT实验