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荧光定量PCR real time-PCR 定量PCR反应体系 定量与常规PCR的差别 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 PCR分四个阶段 如何定量？ Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 定量原理 起点定量与终点定量 荧光化学 SYBR Green 1 TaqMan SYBR Green I 工作原理 。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光 SYBR Green I 应用范围 起始模板浓度定量 融解曲线分析 ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体 基因型分析 SYBR Green I 优点 PCR程序指南 UNG酶使用原理 金牌Tag酶活性 参比荧光：管家荧光ROX 96孔板设置举例 PCR曲线 标准曲线 * ⑩stat ⑧vlg ⑥aly ④achi ②actin ⑨stat ⑦vlg ⑤aly ③achi ①actin 5ul H20 0.5ul 引物2 0.5ul 引物1 10ul Tag mixture 4ul 模板cDNA 26.47 ng/ul 17.738 ng/ul ② ④ ⑥ ⑧ ⑩ 686.75 ng/ul 443.45 ng/ul ① ③ ⑤ ⑦ ⑨ 2♂ 模板 1♀ 模板 定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析 三个关键词： 实时，定量，荧光 确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 TaqMan G T T T G G C C C C C C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A G T T T T T T G G G G C C C C C C C C A A A A A T A C C G G G G T T A C G A A C G G T A A T 未结合SYBR Green 1 dye 变性: 无荧光信号 SYBR Green I 缺点 ROX校正效果 *
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