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龙胆泻肝丸微生物限度检查方法验证 2010版中国药典 ?目的：建立一种龙胆泻肝丸微生物限度检查方法。方法：采用药典规定的常规法和稀释法，通过验证确认所采用的方法是否适合于*该药品的细菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。 结果：细菌、霉菌和酵母菌方法验证中回收率在70%以上;控制菌方法验证中阳性对照菌检出，阴性对照菌未检出。 结论：龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌、霉菌和酵母菌数可以采用常规法或稀释法进行检查，控制菌检查可以采用常规法检查。 培养基 营养琼脂培养基、 玫瑰红钠琼脂培养基、 胆盐乳糖培养基、 胆盐乳糖发酵培养基、 营养肉汤培养基、 改良马丁液体培养基、 改良马丁琼脂培养基、 MUG培养基、 靛基质试液。 ?菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、 白色念珠菌[CMCC(F)98001]、 黑曲霉[CMCC(F)98003] 菌液的制备 ?大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时; 取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6或10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。 ?白色念珠菌菌液制备 取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时; 取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6或10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。 黑曲霉菌液制备 　取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，吸至无菌试管中， 取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。 供试液的制备 取供试品10g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪混匀，作为1:10供试液。 稀释3个梯度。 回收率测定 细菌回收率测定 ?试验组 　稀释法：取1:10供试液1ml等量分注入于5个平皿中，每个平皿加试验菌 (10-6约50～100cfu)1ml，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。 菌液组 取上述试验菌液，测定每一菌株所加的试验菌菌数。采稀释法，取试验用的菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别注入5个平皿中，立刻倾注培养基，每株试验菌平行制备2次，按平皿法测定其菌落数。 ?供试品对照组 ?稀释法：取1:10供试液1ml等量分注于5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。 稀释组 取稀释液1ml等量分注于5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。 霉菌、酵母菌回收率测定 ?试验组 ?取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别同时注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置23～28℃培养72小时，逐日观察结果。 ?菌液组 取上述试验菌液，测定每一菌株所加的试验菌菌数。采取平皿法，取试验用的菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别注入平皿中，立刻倾注培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 供试品对照组 ?取1:10供试液1ml注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠培养基，待凝固后，置规定温度培养72小时，逐日观察结果。 稀释组 取稀释液1ml等量分注于5个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置23～28℃培养72小时，逐日观察结果 控制菌方法的验证 　取2瓶100ml胆盐乳糖培养基，分别加入1:10供试液各10ml，其中1瓶加入大肠埃希菌液1ml,另1瓶加入金黄色葡萄菌液1ml，置35～37℃培养24小时。 分别取上述培养液0.2ml接种于5mlMUG培养基中，培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。 试验重复3次（表2） 讨论 由表1结果看出，细菌、霉菌和酵母菌试验组的回收率在70%以上，说明龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌数和霉菌、酵母菌数可以采用常规法和稀释法两种方法中的任一种进行测定。 由表2结果可以看出，阳性对照菌检出，阴性对照菌未检出，说明龙胆泻肝丸控制菌检查可以采用常规法测定。 * * 供试品:　龙胆泻肝丸。 *