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高效液相色谱培训p.pptx

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高效液相色谱培训p

HPLC的 使用与维护 分析与制剂研究室 胡锋 基本原理和特点 液相色谱仪器部件 实验操作与应用 日常维护 基本原理和特点 基本原理:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出. 特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。 一些商品化仪器 脱气装置 四元泵 检测器 柱温箱 样品盘 控温箱 流动相 启动液相色谱仪器的流程 开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源, 待设备通过自检后,打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相 过滤,脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵 高效液相色谱仪组成 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统 液相色谱流程图 液相色谱的流动相 液相柱---保留值与pH的关系 pH变化值 0.1 RS变化值1.6 色谱柱:Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相:27%甲醇:73%磷酸 pH: 2.52.6 温度: 50℃ 流速: 1.0mL/min. 2. 流动相类别 按流动相组成分:单组分和多组分 按极性分:极性、弱极性、非极性 按使用方式分:等度洗脱和梯度洗脱 对溶剂的要求 水: 去离子水 自动纯水仪    纯净水   商品瓶装水 溶剂: 色谱纯(甲醇,乙腈,乙醇,丙酮,异丙醇)  试剂: 分析纯 不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水,并通过0.22um的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。 过滤:0.45um或更小孔径滤膜 目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响: 1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积 2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形 3)检测器中的气泡产生基线波动 过滤与脱气 流动相的保存 有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: 当日现配现用: 低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长 有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发 选用适宜的容器 1.梯度洗脱的特点 (1)改善分离, 加快分析速度; (2)改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测; (3)增加峰容量; (4)强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好; (5)下次分析时, 流动相需要一段平衡时间;不同溶剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移 2.梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成; ② B 流动相/强溶剂组成; ③ 梯度时间; ④ 梯度曲线:线性、凸型或凹型等。 梯度洗脱 梯度:低压混合 低压梯度 用单泵产生梯度,泵前(低压端)混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当,梯度的 准确性受影响 滞后体积(系统 体积)设计合理 梯度滞后:系统体积的影响 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如:滞后体积为2.0ml,流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应,没有问题 对微柱色谱影响更大,同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应,不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统,滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果: 梯度的准确性不好,造成:方法的适应性不好 用静态梯度混合器;固定滞后体积可明显改善梯度特性 液相色谱的色谱柱 色谱柱的连接 Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 锥箍锥度不合适造成渗漏 色谱柱的连接 除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右),再补充新的固定相。 色谱柱吸附未被洗脱成分时,柱效将明显下降,选合适的溶剂进行洗净。 采用梯度洗脱时,柱在重

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