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高效液相色谱培训p
HPLC的使用与维护
分析与制剂研究室 胡锋
基本原理和特点
液相色谱仪器部件
实验操作与应用
日常维护
基本原理和特点
基本原理:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.
特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。
一些商品化仪器
脱气装置
四元泵
检测器
柱温箱
样品盘
控温箱
流动相
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
打开泵、自动进样器、检测器电源, 待设备通过自检后,打开计算机启动 色谱管理软件
准备流动相
过滤,脱气
色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
高效液相色谱仪组成
输液系统
进样系统
分离系统
检测系统
数据记录处理系统
液相色谱流程图
液相色谱的流动相
液相柱---保留值与pH的关系
pH变化值
0.1
RS变化值1.6
色谱柱:Zorbax StableBond C18
4.6*250mm,5um
流动相:27%甲醇:73%磷酸
pH: 2.52.6
温度: 50℃
流速: 1.0mL/min.
2. 流动相类别
按流动相组成分:单组分和多组分
按极性分:极性、弱极性、非极性
按使用方式分:等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水:
去离子水 自动纯水仪
纯净水 商品瓶装水
溶剂:
色谱纯(甲醇,乙腈,乙醇,丙酮,异丙醇)
试剂:
分析纯
不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质要求越高放置时间越短。
理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水,并通过0.22um的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤:0.45um或更小孔径滤膜
目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡
气泡对测定的影响:
1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积
2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形
3)检测器中的气泡产生基线波动
过滤与脱气
流动相的保存
有机溶剂流动相:
室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
当日现配现用:
低温下密封保存,一般不超过3天
防止微生物生长
有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:
低温密封保存
防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1.梯度洗脱的特点
(1)改善分离, 加快分析速度;
(2)改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测;
(3)增加峰容量;
(4)强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好;
(5)下次分析时, 流动相需要一段平衡时间;不同溶剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移
2.梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成;
② B 流动相/强溶剂组成;
③ 梯度时间;
④ 梯度曲线:线性、凸型或凹型等。
梯度洗脱
梯度:低压混合
低压梯度
用单泵产生梯度,泵前(低压端)混合
对脱气要求高
不易调节梯度的滞后体积
如设计不当,梯度的准确性受影响
滞后体积(系统体积)设计合理
梯度滞后:系统体积的影响
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼
器、混合器及其管路
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
例如:滞后体积为2.0ml,流速1.0ml/min
实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应,没有问题
对微柱色谱影响更大,同上例但流速0.1ml/min
实际梯度会比设置值晚20 分钟响应,不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦
滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现
滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统,滞后体积随反压变化
滞后体积随反压变化的后果:
梯度的准确性不好,造成:方法的适应性不好
用静态梯度混合器;固定滞后体积可明显改善梯度特性
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
锥箍锥度不合适造成渗漏
色谱柱的连接
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右),再补充新的固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时,柱效将明显下降,选合适的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时,柱在重
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