水稻细胞中蛋白质的免疫金标亚细胞定位-Bio-protocol.PDF

/e1010126 DOI:10.21769/BioProtoc.1010126 水稻细胞中蛋白质的免疫金标亚细胞定位 Subcellular Localization of Proteins in Rice Cells Using Immunogold Labeling Technique 曹剑波，邵林，袁猛* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：myuan@ 引用格式：曹剑波，邵林，袁猛. (2018). 水稻细胞中蛋白质的免疫金标亚细胞定位. Bio-101 e1010126. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010126. How to cite: Cao, J. B., Shao, L. and Yuan, M. (2018). Subcellular localization of proteins in rice cells using immunogold labeling technique. Bio- 101 e1010126. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010126. (in Chinese) 实验原理：根据抗原与抗体的特异性结合原理，结合透射电镜对细胞超微结构的成像 技术，利用胶体金颗粒具有高电子密度的特性，金标抗体结合处在透射电镜下呈现黑 色颗粒。 实验目的：根据金标抗体在细胞中的位置，来确定目的蛋白质(抗原)在细胞中的分布。 关键词：免疫金标，蛋白质亚细胞定位，透射电镜 材料与试剂 1. 2 ml 离心管 2. 吸管 3. 注射器 4. 牙签 5. 培养皿 6. 液氮50 L 7. 包埋模具 (geltin 胶囊) 8. 玻璃条 9. 铜网 10. 铜网镊子 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010126 DOI:10.21769/BioProtoc.1010126 11. 细毛笔 12. 滤纸 13. 蜡板 14. 乙醇(国药试剂) 15. 多聚甲醛 16. 25%戊二醛(进口品质) 17. NaH PO ·2H O 2 4 2 18. Na HPO ·12H O 2 4 2 19. NaCl 20. PBS 21. NaOH 22. LOWICRYL K4M Embedding Kit (Electron Microscopy Science, USA, catalog number: 14330) 23. TWEEN20 24. BSA 25. Glycine 26. 0.01 M PBS, pH 7.2 缓冲液 (见溶液配方) 27. 固定剂 (见溶液配方) 28. 脱水剂 (见溶液配方) 29. 包埋剂 (见溶液配方) 30. PBST (见溶液配方) 31. 阻断液 (见溶液配方) 32. 醋酸铀染液 (见溶液配方) 仪器设备 1. 天平 2. 玻璃棒 3. 量筒 4. 烧杯 5. 酒精灯 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010126 DOI:10.21769/BioProtoc.1010126 6. 手术剪刀 7. 眼科镊子 8. 冰箱 9. 紫外聚合仪 (Leica EM AFS2, Germany) 10. 玻璃刀制刀机 (Leica KMR3, Germany) 11. 钻石刀 (超薄级，DiTOME, Switzerland) 12. 超薄切片机 (Leica UC6, Germany) 13. 透射电子显微镜 (H-7650, Japan) 14. 真空泵 实验步骤 1. 取样：以下所有操作均在冰上进行。将水稻组织切成小块，每份样品至少取 10 个 小块，迅速置于预冷的4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的混合固定液中，抽真空至样品 沉底后再继续抽2 h。4