《GBT17999.9-1999-SPF鸡间接免疫荧光试验》.pdfVIP

GB/r17999.9-1999 前 言 鸡传染性贫血(CIA)，是近年来新发生的鸡病，国外均对其进行监测.CIA在我国鸡群中也有流行， 因此，SPF鸡微生物学质量控制国家标准将其列入监测项目。目前国内已建立了SPF鸡监测CIA的通 用方法一 间接免疫荧光试验(IFA)，该方法已得到应用和验证，在此基础上制定本标准 SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检 测方法。本标准为 S《PF鸡 间接免疫荧光试验》。 SPF鸡微生学检测方法还包括以下部分: GB/T17999.1-1999SPF鸡 红细胞凝集抑制试验; GB/T17999.2-1999SPF鸡 血清中和试验; GB/T17999.3-1999SPF鸡 血清平板凝集试验; GB/T17999.4--1999SPF鸡 琼脂扩散试验; GB/T17999.51999SPF鸡 酶联免疫吸附试验; GB/T17999.6-1999SPF鸡 胚敏感试验; GB/T17999.7-1999SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验; GB/T17999.8--1999 SPF鸡 试管凝集试验。 本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。 本标准由农业部畜牧兽医司归口。 本标准起草单位:北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业部实验动物研究中心。 本标准主要起草人:周文平、赵立红、陈德威。 中华人 民共和 国国家标准 SPF鸡 间接免疫荧光试验 GB/r17999.9一1999 SPFchicken-Indirectimmunofluorescentassay 1 范围 本标准规定了间接免疫荧光试验试剂、材料、操作程序及结果判定等 本标准适用于SPF鸡感染鸡传染性贫血病毒(ChickenInfectiousAnaemiaVirus,CIAV)后的抗体 监测 2 原理 间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的 抗抗体结合，形成抗原一抗体一抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧光 因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗原及荧光色素标记 的抗抗体检测相应的抗体。 3 试验和器材 3.1 试剂 3门门 阴性、阳性血清 3.1.2 被检血清 3.1.3PBS(0.01M,pH7.2)o 3.1.4FITC一免抗鸡IgG(按说明稀释使用)。 11.5 缓冲甘油 3.2 材料 3.2.1 湿盒。 3.2.2 培养箱。 3.2.3 荧光显微镜。 4 操作程序 车 J I 感染细胞的制备 用MDCC-MSB-1细胞制备鸡传染性贫血病毒感染细胞及未感染细胞(病毒培养技术参见有关文 献 、 车 L 勺 抗原片的制备 4.2.1 收集培养48h的细胞培养物，1500r/min离心10min，弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物三 次，以少量PBS重悬细胞。 4.2.2取10pI细胞悬液(含细胞10个)，滴加于镀膜印孔载玻片各孔中，同时制备未感染细胞对照 片。 一一一-一~~一一一一一~~~~~~~一 国家质1E技术监督局1999一11一10批准 2000一04一01实施 GB/T 17999.9--1999 4.2.3滴好的抗原片用热风吹干，冷丙酮(4C)固定10min，保存于一10C，一周内使用。 4.3 间接荧光抗体染色 4.3.1取出抗原片室温放置10min待用 4.3.2用PBS将灭活被检血清，阴性、阳性血清分别稀释成I:100,1:500两个稀释度，分别取10pL 滴加于抗原片各孔中。 4.3.3 将加样抗原片置于湿盒内，37C孵育30min, 4.3.4 用PBS浸洗三次，每次10min, 4.3.5取20pLFITC一兔抗鸡工gG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育、洗涤同前。 4.3.6 用缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察 5 结果判定 CIAV感染细胞结构清晰，核内见清晰的荧光颗粒(未感染细胞中无荧光颗粒)