滚环扩增型压电石英晶体传感器检测乙型肝炎病毒.PDF

Vol.35 高等 学校 化 学 学报 No.8 2014年8月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 1635~1639 doi:10.7503/ cjc 摇 摇 滚环扩增型压电石英晶体传感器 检测乙型肝炎病毒 姚春艳,王云霞,府伟灵 (第三军医大学西南医院检验科,重庆400038) 摘要摇 通过捕获探针与纳米金膜之间的共价连接,保证了滚环扩增(RCA)产物始终结合于金膜表面,Phi29 DNA聚合酶的高效扩增和Escherichia coli DNA链接酶的高度精确性使检测达到单碱基识别,检测灵敏度达 到10 copies/ mL. 实验结果表明,与单碱基错配序列相比,RCA可明显增强检测的灵敏度. 该 RCA基因传4 感器操作简单,灵敏度和特异性较高,在乙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力. 关键词摇 滚环扩增;石英晶体传感器;乙型肝炎病毒 中图分类号摇 O657摇 摇 摇 摇 文献标志码摇 A摇 摇 摇 摇 压电生物传感器是利用石英晶体对质量变化的敏感性,结合生物学识别反应而形成的一种自动化 分析检测系统,其灵敏度取决于石英晶体的响应频率,该传感器具有灵敏度高、特异性好、 响应快及 [1,2] 小巧简便等特点 . 其中压电石英晶体传感器可对多种待测物进行实时、快速、连续的定量测定及反 应动力学研究,克服了传统免疫检测方法费时、 昂贵、标记及操作繁琐等缺点,具有广泛的发展前景 和临床使用价值[3~8]. 用压电石英晶体传感器检测核酸分子时,为了达到液相中核酸分子的检测灵敏 度,多采用聚合酶链式反应(PCR)或T7 多聚酶对靶分子进行预扩增,这些扩增步骤既增加了检测成 本,也容易造成非特异性扩增. 近年来,分子生物学技术的进展为核酸扩增提供了多种可能,其中滚 环扩增技术(RCA)是一种无需温度循环和产物分离的新型扩增技术[9,10]. 在RCA过程中引物结合到 环状模板上,在DNA聚合酶的作用下不断延伸,可产生与环状模板互补的大量重复序列线状单链产 物[11~13]. 目前,RCA技术已应用于DNA、RNA、蛋白及单碱基多态性(SNP)的检测. RCA技术的优点 在于无需扩增仪,同时其单链扩增特性使扩增产物的一端可始终连接于固相载体,非常适合于固相形 [14] 式的传感器信号检测. 俞汝勤等 将RCA技术与电化学方法结合进行了蛋白质的系列检测研究. 肝炎是世界性的公共健康问题,在亚洲国家乙型肝炎病毒(HBV)是肝脏疾病的主要诱因,与肝癌 及肝硬化密切相关. 中国的乙型肝炎病毒感染呈高发趋势,有1郾2亿人携带乙型肝炎病毒[15,16]. 目前, 在临床上应用的乙型肝炎病毒检测手段包括化学发光法、等位杂交技术、巢式PCR(Nested鄄PCR)、反 转录PCR(RT鄄PCR)及基因传感器[17,18]等. PCR扩增技术是最常用的临床诊断技术,但该方法操作繁 琐,且需要高精度的仪器设备, 因此开发一种简便、 特异且高灵敏度的检测方法尤为重要. 本文将 RCA技术与压电生物传感器相结合,建立了一种新型高灵敏度的乙型肝炎病毒检测方法,将 RCA 的 高扩增特性与压电生物传感器的高灵敏性相结合,实现了乙肝病毒核酸分子的高灵敏度检测. 1摇 实验部分 1.1摇 试剂及HBV DNA 的提取 实验所用序列均购自大连Takara生物技术公司(序列见表1),其中捕获探针的5忆端经巯基修饰后 固定于金膜表面;Phi29 DNA 聚合酶、Escherichia coli DNA扩增酶及dNTPs均购自Takara生物技术公 收稿日期:2014鄄06鄄06. 基金项目:国家自然科学基金(批准号81371885)资助. 联系人简介:府伟灵,男,博士,教授,博士生导师,主要从事生物传感器与分子生物学研究. E鄄mail:weilingfu@ 1636