基于IgY的双抗体夹心ELISA法在日本血吸虫循环抗原检测中的初步应用-病原生物学专业论文.docxVIP

基于 IgY 的双抗体夹心 ELISA 法在日本血吸虫 循环抗原检测中的初步应用 中文摘要 血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，是发展中国家的主要寄生虫病 之一。我国长江中下游及两湖地区仍有不少人群受到血吸虫病的危害，因此，血防工 作所面临的形势仍然十分严峻。血吸虫病的诊断是血吸虫病防治的中心环节，涉及治 疗及预后。我国长期以来是将病原学检查即从粪便中查出虫卵或孵化出毛蚴作为血吸 虫病诊断的金标准，并用以确定流行率，但随着控制血吸虫病策略的实施，经反复化 疗，流行区病人的感染率和感染度明显下降，单纯依靠粪检不能满足血吸虫病诊断的 需要，因此免疫学诊断方法已成为血吸虫病诊断的重要手段。我国学者从 50 年代开 始致力于免疫诊断方法的研究，当前免疫学诊断主要是循环抗体和循环抗原的检测。 检测循环抗体的敏感性和特异性虽较好，但难以区分现症感染和既往感染，也无法考 核疗效，不利于血吸虫病的监测。循环抗原的检测可评估虫荷数和活动性感染，具有 较好的疗效考核价值，同时还可作为现症感染的依据。但目前循环抗原的检测存在着 敏感性低、特异性不理想等问题。因此，如何提高循环抗原检测的敏感性、特异性成 为近年来研究的热点。 鸡卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin, IgY）是鸡血液中的 IgG 被选择性 转移到卵黄中形成的，而且是卵黄中的惟一免疫球蛋白类。IgY 的结构与 IgG 相似， 但在免疫诊断方面比哺乳动物源性的 IgG 更具优势：（1）由于种系之间发生距离大， 母鸡可对哺乳动物产生更强的免疫应答。（2）母鸡可以持续地产生高亲和力的抗体。 较少的抗原量就可以从免疫母鸡的卵黄中得到长效的高滴度 IgY 抗体。（3）无创性地 收集抗体。（4）可快速简单地分离 IgY。（5）IgY 不能结合类风湿因子，可避免 IgG 因结合类风湿因子而造成的假阳性。（6）IgY 不激活哺乳动物的补体。哺乳动物的 IgG 可激活补体，导致假阳性的产生。IgY 不和补体发生反应，在检测哺乳动物的血清时， 可减少由补体造成的干扰。 由于 IgY 抗体能提高免疫检测的敏感性、特异性，还具有产量大、性质稳定等优 点，近年来，IgY 在疾病的诊断方面得到了广泛的应用。本研究拟制备抗日本血吸虫 可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigen, SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY），并用基于 IgY 的双抗体夹心 ELISA 来检测血吸虫病人血清中的循环抗原。 本研究首先制备和鉴定了抗日本血吸虫 SEA 的 IgY。日本血吸虫 SEA 经皮下免 疫 25 周龄的莱杭母鸡 4 次，免疫剂量为 100μgSEA/只，免疫间隔 10 天，于末次免疫 后一个月加强免疫一次。用 EGGstract IgY Purification System 提纯 IgY，BCA 法测定 其蛋白含量，并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDA）分析。结 果发现，每枚鸡蛋经 EGGstract IgY Purification System 提纯后可得到约 69mg 抗体。 经 SDS分析，EGGstract IgY Purification System 提纯的完整的 IgY 有一条主要 蛋白带，相对分子质量（Mr）为 130 000；裂解后的 IgY 包含 66 000 和 35 000 的两 条带和其它五条带。 应用间接 ELISA 法检测免疫后 30d-60d 的 IgY 抗体的特异性。每孔 SEA200ng/ml 包被 4℃过夜，次日 pH7.4 PBS-Tween20(0.05%)洗涤 3 次、甩干，加 10%BSA 100μl/ 孔 37℃封闭 2h，洗涤、甩干。每孔加 1:80 稀释的免疫后不同时间的 IgY 100μl，37℃ 温育 1h；洗涤后加入辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记的兔抗鸡 IgY（工作浓度为 1:1000）100μl，37℃温育 1h；加四甲基联苯胺（Tetramethyl benzidine,TMB）37℃显色 15min，2mol/L 硫酸终止反应，在酶标仪上读取吸光度（A450 值），并计算 S/N 值。结果表明，免疫后 30d-35d 的 IgY 作 ELISA 检测时 S/N 值最高， 直到第 60d，结果仍为阳性，表明免疫后 30-60d 的 IgY 均可用于抗原的检测。 我们应用基于 IgY（30d-35d）抗体的双抗体夹心 ELISA 法检测了 15 例日本血 吸虫病人血清，同时做交叉反应，检测了 10 例肝吸虫病人血清及 10 例肺吸虫病人 血清。以 15μg/ml 的 IgY 作为捕获抗体，包被 96 孔酶标板，4℃过夜，pH7.4 PBS-Tween20