试验九IMViC与硫化氢试验.DOC

实验九 IMViC与硫化氢试验 一、实验目的 了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 IMViC： I－吲哚（indol test） M－甲基红（methyl red test） V－伏-普（Voges-Prolauer test） C－柠檬酸盐（citrate test） 硫化氢（H2S） I-吲哚（indol test） 色氨酸＋H2O 色氨酸酶 吲哚＋NH3＋丙酮酸 吲哚+ 对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚（红色） 部分细菌能产生色氨酸酶，从而具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生化检测指标。 大肠杆菌产色氨酸酶阳性（红色） 产气肠杆菌不产色氨酸酶阴性（无色） M-甲基红（methyl red test） 甲基红指示剂 橘黄色（pH6.3） 红色（pH4.2） 细菌代谢糖产生酸使培养基变酸（pH下降），使甲基红指示剂变色。 所有肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌和产气肠杆菌有区别： 两者在培养早期产生有机酸，但大肠杆菌在培养后仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则将有机酸转化为非酸性产物，使pH上升至6左右。 大肠杆菌阳性（红色） 产气肠杆菌阴性（黄色） V-伏-普（Voges-Prolauer test） 葡萄糖 丙酮酸-CO2缩合 乙酰乳酸 -CO2脱羧 乙酰甲基甲醇 +OH--2H 胍基+二乙酰红色化合物 测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物（如丙酮酸）的能力。 大肠杆菌不产丙酮酸阴性（无色） 产气肠杆菌产丙酮酸阳性（红色） 碱性条件；加入少量含胍基的化合物可使反应更明显。 C-柠檬酸盐（citrate test） 有些细菌以柠檬酸钠为碳源，培养基中的柠檬酸和磷酸铵被分解后，产生碱性化合物，使pH升高。 培养基（1％溴麝香草酚蓝）：绿色 深蓝色 溴麝香草酚蓝： pH＜6 黄色 pH 6～7 绿色 pH ＞7 蓝色 大肠杆菌不能利用柠檬酸盐阴性（绿色） 产气肠杆菌能利用柠檬酸盐阳性（蓝色） 硫化氢实验 含硫有机物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分细菌分解产生H2S， H2S和培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。 大肠杆菌不能分解阴性（无沉淀） 产气肠杆菌能分解阳性（黑色沉淀） 三、实验器材 1 菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌 2 培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐斜面培养基、醋酸铅培养基。 四、操作步骤 1 接种与培养 穿刺法分别接种两菌于2支醋酸铅培养基（H2S），37℃培养48h。 分别接种两菌于2支蛋白胨水培养基（I）、 2支葡萄糖蛋白胨水培养基（M＆V），37℃培养2d。 划S曲线法分别接种两菌于2支柠檬酸盐斜面培养基（C）， 37℃培养2d。 2 结果观察 H2S实验：观察是否有黑色硫化铅沉淀产生。 吲哚实验：2d后的培养物内加3～4滴乙醚，摇动数次，静至1～3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐滴加2滴吲哚试剂，产生红色环状物者为阳性反应（注意最好选用色氨酸含量高的蛋白胨培养基）。 甲基红实验： 2d后的培养物内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者为阴性（注意甲基红不要过量，以免出现假阳性）。 伏－普实验： 2d后的培养物内加5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％-萘酚溶液，用力振荡， 37℃保温15～30min，以加快反应速度。红色为阳性。 柠檬酸盐实验：观察2d后的培养物上有无细菌产生及其颜色，蓝色为阳性，绿色为阴性。 五、实验报告 1.结果 将实验结果填入下表。“＋”表示阳性反应，“—”表示阴性反应。