第十四讲生1目的基因导入受体细胞.pptVIP

第一节 重组DNA分子导入植物细胞 植物转基因方法有三类： ⑴载体介导的转化方法； 概念：将目的DNA插入到农杆菌的Ti质粒或病毒的DNA上，随着载体质粒DNA的转移而转移。 农杆菌介导法 ⑵DNA直接转化法； 通过物理或化学的方法 ⑶种质系统法； 花粉管通道法、胚囊子房注射法 1 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。 当植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类物质，如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。 1.1 选择转化外植体应具备的条件 ①优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。 ②要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。 ③转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。 ④应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。 1.2 农杆菌接种操作步骤 ①外植体的农杆菌接种 将切成小块的外植体浸泡在制备好的农杆菌液中，浸泡一段时间后，进行共培养。 注意：A 浸泡时间 B 工程菌的浓度 通常采用较低的菌液OD值和较短的浸泡时间来进行外植体的接种。 ②农杆菌与外植体的共培养 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上。农杆菌附着、T-DNA的转移及整合都在这个时期完成。 注意：不同物种、外植体种类和农杆菌菌株的最佳共培养时间有所不同。 烟草叶片 2d 马铃薯块茎 2-4d ③脱菌培养 原因：与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正常生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的生长。 方法：是指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。 时间：需5-6次继代培养 抗生素：目前使用最多的是头孢霉素，浓度500mg/L ④筛选培养 将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。 2 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建 立多种转化方法 ⑴叶盘转化法 ⑵整体植株接种转化法 ⑶原生质体共培养转化法 ⑷悬浮细胞共培养转化法 ⑴ 叶盘转化法 无菌叶盘 接种 愈伤再生植株 ⑵ 整体植株接种转化法 在整体植株上造成创伤 接种（注射器注射） 愈伤再生植株 要求：一般采用无菌的种子实生苗或试管苗 ⑶原生质体共培养转化法 嫩叶制备原生质体 与含重组Ti质粒的农杆菌混合培养 （农杆菌：原生质体=100：1） 32h后，收集原生质体，加羧苄青霉素杀死农杆菌 3-4周，形成小愈伤组织，形成再生植株 特点：获得的转化植株来自同一个转化的细胞 ⑷悬浮细胞共培养转化法 此方法类似于原生质体共培养转化法，主要差别是首先建立悬浮细胞系。 3 植物病毒介导的感染 目前，利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略： ⑴植物细胞原生质体感染； ⑵植物组织感染 例：植物双生病毒，成熟的病毒呈双颗粒状，每一颗粒中有一条不同的DNA单链。只有A和B同处一个植物细胞中，才形成具有感染力的病毒。 4 基因枪法 又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法。 5 电击法 细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后，被击穿的膜孔可被修复。 6 显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 此方法的植物样品主要有单细胞、原生质体、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。 关键是细胞的固定技术。 7 激光微束法 此方法是利用直径很小，能量很高的激光微束能引起细胞膜可