液相色谱柱的应用.pptVIP

液相色谱柱的应用 目 录 一、 HPLC分离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件) 分配过程 分配系数 - K K= K= 常数 （T恒定） Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度 容量因子k 色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标 色谱理论：速率理论--影响柱效的因素 速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程式）。 速率方程　　　H = A + B/u +C·u H：理论塔板高度； u：流动相的线速度 色谱理论：速率理论--影响柱效的因素 H = A + B/u +C·u 色谱理论：分离度 样品组分的分离 色谱柱的构造 .色谱柱管 常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。 色谱柱规格 内径：常用4.6mm，2.1mm 柱长：常用50，100，150，250cm 分离模式的选择 1.填料：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基等（封端技术） 3.孔径：60-100A 分子量2000 300A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备） 6.长度：10、15、25、30mm 正相 反相色谱 正相色谱 反向色谱法 各种反相填料的使用比例 反向色谱法 流动相 柱填料基质 色谱柱的性能参数 A型、B型硅胶比较 金属敏感测试 色谱柱 Diamonsil（钻石）C18 5um，150 x 4.6mm 流动相 CH3CN / Water (50:50) 流速 1.0 mL/min 检测 UV@230nm 硅胶中如果存在金属杂质，将与2,3- 二羟基萘（峰2）形成金属螯合物，保留时间延长并导致峰形拖尾。2,7- 二羟基萘（峰1）不与金属作用并作为内标物。 填料粒度 粒径与柱效 核壳U-HPLC的科学原理 美国Advanced Material Technology Inc. Kirkland博士发明 。 内核1.7 um, 因此柱效至少相当于UPLC; 外层0.5um, 总粒径2.7um, 因此色谱柱压力接近3.0um色谱柱 。 比表面积的比较 比表面积与孔径的影响 碳载量 碳载量是指固定相中碳的含量 不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。 一般C18、C18的碳载量为10%~14%，高的可达18%~20% 碳载量 封端技术 封端 --- 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异 超临界封端技术 传统封端：固-液回流封端，封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中（甲苯），与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等。硅胶小孔难到达。 超临界封端：封端试剂和催化剂由CO2超或亚临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态下扩散系数是固-液回流状态的1000倍，能充分扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基。 碱灭活测试 色谱柱 Diamonsil（钻石）C18 5um，250 x 4.6mm 流动相 CH3OH/ H2O (49:51) 流速 1.0 mL/min 检测 UV@254nm 如果硅胶表面已经被完全化学改性，乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力，所以不会分离并共同洗脱出来。 封端技术比较 pH值对保留时间的影响 色谱柱的评价 溶剂前处理 过滤：0.45um或0.22um孔径滤膜 目的：除去流动相和样品溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 试剂纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的 气泡 气泡对测定的影响： 1）柱流量不准