流式细胞术Flow Cytometry课件.pptVIP

二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究 1. 肿瘤诊断 DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。 2倍体 异倍体 4倍体 肿瘤组织中的各种DNA倍体 2. 凋亡研究 在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。 检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。 Annexin V Assay 图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 图 FCM测试细胞周 期分布和凋亡 根据凋亡细胞的特点来检测 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 凋亡细胞的FSC ？SSC ？ 细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，SSC ？ CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。 三）淋巴细胞分类 流式细胞术检测细胞表型 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。 四）白血病的免疫分型 五） 细胞内蛋白的分析： 细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含量。荧光探针多为FITC。 荧光信号 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 荧光样本制备 双色直接染色 端粒（荧光蛋白） 　　 六）细胞内钙离子测定 1×106/ml的细胞悬液， 加入终浓度为1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60分钟。 以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。 FCM检测胞内钙离子、 膜电位和线粒体功能 M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即：所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。 六. 分选： 用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每秒钟300个细胞， 大型机分选速度可达到每秒上万个细胞 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪 蛋白电泳 多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易 谢 谢 大 家 流式细胞术 Flow Cytometry （FCM） 什么是流式细胞仪 ●流式细胞仪实物 BD FACSVantage BD-Calibur 1. 发展历史 1934 Moldavan 1973 Steinkamp 一、??概述 2. 定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术. 3. 特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测