流式细胞术及其应用.pptVIP

流式细胞仪特点 FACSCalibur FACSAria FACS Vantage DiVa 样品制备 Annexin V-PE/ PI双染色法 Intracellular Cytokine-Protocol 细胞周期分析： G1 M G2 S Quiescent cells G0 1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37℃消化1小时 过300目细胞筛 50μl 0.1mg/ml PI（含1%Triton)， 1000rpm5分钟 离心 两次 混匀，室温 静止5分钟 上机 DNA 流式检测的主要指标 DNA 含量: ploidy：细胞内染色体DNA含量 DI：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细 胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性 SPF：S期细胞占总周期细胞的比例 PI：增殖细胞占总周期细胞的比例 CV： G0/G1期细胞DNA含量变异系数 G1 S phase G2 M G1 1 2 1 DNA content The Cell Cycle DNA content by flow cytometry Deconvolution into cell cycle phases G0/1 G2/M S Events 细胞凋亡测定：Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞） 双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 双阳：晚期凋亡细胞 PI 单阳：坏死细胞 * PerCP-叶绿素蛋白、Cy5-化青素、PE-藻红蛋白 * * FLOW CYTOMETRY 流式细胞技术 流式细胞术 以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性或定量分析的技术。 单细胞悬液或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞定量分析技术 特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析 台式机 科研型 特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析 科研型（大型机） 特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选 第一节  流式细胞仪－Introduction 鞘液系统 光路系统 数据系统 鞘液系统 光路系统 光学原理 Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 光收集系统：滤光片 光学检测信号 数据系统 流式细胞分析的信息 Forward scatter(FSC) Side scatter(SSC) FL1-FITC FL2-PE FL3-PerCP FL4-APC 流式细胞的基本信息: “形态” 流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4 最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合 流式常见图形 (Histogram Plot) 适用于：单参数分析 流式常见图形 (Dot Plot) 适用于：多参数分析 流式常见图形 (Gating) 第二节  流式细胞术的科研应用 分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量 流式应用常见范围 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列等 细胞浆内分子：胞内细胞因子等 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 实验标本的处理 单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 细胞染色 染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标