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* * 免疫标记技术 Immunolabeling technique 1. ELISA检测HBsAg (小组做) 实验内容 2. 尿液HCG检测(胶体金法)(小组做) 实验目的 1.掌握酶联免疫吸附实验的基本原理； 2.了解利用双抗体夹心法测定HBsAg的方法。 3. 了解胶体金法检测HCG的原理、方法。 免疫标记技术=免疫技术+ 标记技术 酶 荧光素 同位素 抗原抗体反应 示踪物标记 特异性 灵敏性 免疫标记技术主要特点 高特异性 高灵敏性 免疫标记技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫荧光技术 其它标记技术 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术 基本原理 利用酶具有催化底物的生物放大作用,来提高抗原-抗体反应（特异性）检测敏感性的一种免疫标记技术。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应 一、免疫酶技术 EIA 固相载体 聚苯乙烯 Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被 (酶免疫测定法) 基本特点： ①标记后保留酶及抗原(抗体)的活性； ②酶促反应专一性，保证特异性； ③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定； ⑤操作简便，安全易行。 常用酶及其底物 常用底物： 邻苯二胺(OPD)：反应显黄色，应避光，致癌性;终止后显橙色。 四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性, 但水溶性差；终止后显黄色。 常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用不如HRP普及。 1.辣根过氧化物酶(HRP) 2.碱性磷酸酶(AP) 酶联免疫吸附实验 enzyme linked immunosorbent assay ELISA ELISA双抗体夹心法的基本实验过程 双抗体夹心法检测HBsAg HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb HBeAg, HBeAb HBcAb(IgG,IgM) 又称表面抗原,存在于HBV感染的急性期及慢性期的血清中,为感染指标。 实验材料 1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。 实验步骤 2. 在各孔内加入酶标抗体1滴, 37℃温育30分钟。 3. 各孔分别加入洗涤液(加满)---甩掉，反复3次，然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水纸上)。 4. 各孔内加入底物液A、B各1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应15分钟。 5. 各孔内加入终止液1滴，观察结果。 1. 将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、阴性对照血清及待测血清各1滴。 结果判定 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。 1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； 注意事项 2.洗涤必须彻底，防止产生假阳性。 1.加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。 二、胶体金法检测尿液HCG 人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin, HCG) 是受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，胎盘滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。 HCG具有免疫原性和免疫反应性，可以用特异性抗体检测尿液中的HCG以诊断早孕。 胶体金标记实验 (金标法) 胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)； 胶体金颗粒聚集到一定大小后就呈现出酒红色。 早早孕HCG胶体金试纸,采用了双抗体夹心法的检测模式。 1:鼠抗人HCG抗体 2:羊抗鼠IgG 尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物； 随层析作用向上移动,至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色 HCG金标试纸 带条中均匀含有胶体金标记的鼠抗人HCG单抗 在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗(IgG)随着尿液上行,到达质控线与羊抗鼠IgG(二抗)结合而显色，作为质控对照。 *