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实验10 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA 几乎具有等量 净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小 和构型。 一、实验原理 具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。 二、实验仪器 1． 恒温培养箱 2 ．琼脂糖凝胶电泳系统 3 ．台式离心机 4 ．高压灭菌锅 5 ．紫外线透射仪 6 ．凝胶成像系统 三、实验试剂 １．Loading dye (0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液) 　　10ml需0.025g溴酚兰和4g蔗糖 ２．ＥB：需1g溴化乙锭 ３．TBE：５×TBE贮液2L：108g Tris-base、 55g硼酸、40ml 0.5M的EDTA(pH8.0) 需7.4g disodium·2H2O ４．琼脂糖：30g 四、实验步骤 1． 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 2． 调整好梳子的高度； 3． 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完 全溶解，冷却至45-50oC时倒入制胶板中； 4． 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； 四、实验步骤 5． 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； DNA 5μl + ddH2O 3μl + 溴酚蓝2μl 共10μl于0.5ml tube中混合后点样； 6． 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； 7． 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。 五、主要事项 1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： a ． DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA） b． 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr? 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，?为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb 五、主要事项 c． DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 d． 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm 五、主要事项 e． 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃ f． 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) g． 电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 五、主要事项 2． 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3． 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 六、思考题 1、DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？ 2、琼脂糖凝胶有哪些注意事项？ * *