酶蛋白的化学修饰.pptVIP

第三章 酶蛋白的化学修饰 概 念 指通过化学基团的引入或去除，使（蛋白质的）共价结构发生改变，均称为（蛋白质的）化学修饰。 第一节 化学修饰的原理 影响酶蛋白化学修饰的因素： 蛋白质功能基的反应性 修饰剂的反应性 一、影响酶蛋白功能基反应性的因素 1. 微区的极性 2. 氢键效应 3. 静电效应 4. 位阻效应 二、酶蛋白功能基的超反应性 影响超反应性的因素： 1. 蛋白质功能基的pK值 2. 蛋白质功能基的亲核性 3. 静电相互作用 4. 试剂与修饰部位的立体化学适应性 5. 试剂的结合 三、影响修饰剂反应性的因素 1. 选择吸附 2.静电相互作用 3.位阻效应 4.催化因素 5.局部环境的极性 第二节 化学修饰的方法学 蛋白质修饰时，需选择合适的修饰试剂和修饰条件 一、修饰反应专一性的控制 1. 试剂的选择 2.反应条件的选择 3.反应的专一性 （1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 （2）选择不同的反应pH （3）利用某些产物的不稳定性 （4）亲和标记 （5）差别标记 亲和标记 指亲和试剂只与作用部位的特定基团发 生作用，而不与作用部位以外的其它基团发 生作用。 二、修饰程度和修饰部位的测定 1. 分析方法 用光谱法追踪检测：简便，实用，但要求修饰后 的衍生物具有独特的光谱。 用间接法：蛋白质经降解和氨基酸分析后鉴定修 饰部位，测定反应条件。 2.化学修饰数据的分析 （1）化学修饰的时间进程分析 （2）确定必需基团的性质和数目 三、化学修饰结果的解释 1.蛋白质功能改变的解释 2.修饰残基的不稳定性 3.没有被发现的修饰 第三节 酶蛋白侧链的修饰 蛋白质侧链上的功能基主要有： 氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍 基、甲硫基。 修饰反应主要有： 酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、 芳香环取代反应等类型 一、羧基的化学修饰 用水溶性的碳二亚胺修饰 二、氨基的化学修饰 氨基的烷基化 用三硝基苯磺酸（TNBS)修饰，在420nm 和367nm有特定的光吸收。 磷酸吡哆醛（PLP)是一种非常专一的赖氨 酸修饰剂，它与赖氨酸残基反应形成希夫碱 后再用硼氢化钠还原，其衍生物在325nm有 最大的光吸收。 二、氨基的化学修饰 在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰最常 用的有2，4－二硝基氟苯法（DNFB，又称 sanger试剂)，丹磺酰氯（DNS)法等。 另外，氨基还可用乙酸酐、碘代乙酸、酮 类修饰。 三、精氨酸胍基的修饰 具有两个临位羰基的化合物，如丁二酮、1，2－环己二酮和苯乙二醛是修饰精氨酸残基的重要试剂。 四、巯基的化学修饰 5，5－二硫代－双（2－硝基苯甲酸） （DTMB,Ellman试剂）是最常用的巯基修饰 剂，它与巯基反应形成二硫键，释放出1个 2－硝基－5－硫苯甲酸阴离子，此阴离子在 412nm有最大光吸收。该试剂是当前定量酶 分子中巯基数目的最常用试剂。它还用于研 究蛋白质的构象变化。 四、巯基的化学修饰 有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基专一 性很强，修饰产物在250nm有最大光吸收。 N－乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强 的巯基修饰剂，反应产物在300nm有最大光 吸收。 烷基化试剂也是一种重要的巯基修饰剂， 修饰产物稳定，易于分析。 五、组氨酸咪唑基的修饰 常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC)和碘 代乙酸， DPC对组氨酸残基有较好的专一 性，产物在240nm有最大光吸收。 六、色氨酸吲哚基的修饰 N－溴代琥珀酰亚胺（NBS)可以修饰吲哚 基，并通过280nm光吸收的减少跟踪反应。 2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基 苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。 七、酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰 酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳 香环上的取代修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的 羟基一般都可以被修饰酚羟基的修饰剂修 饰，但是反应条件比修饰酚羟基严格些，生 成的产物也比酚羟基修饰形成的产物更稳 定。 八、甲硫氨酸甲硫基的修饰 虽然甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件 下，很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原 子具有亲核性，所以可用过氧化氢、过甲酸 等氧化成甲硫氨酸亚砜。用碘乙酰胺等卤化 烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化。 第四节 酶的亲和修饰 亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特 定基团发生作用，而不与作用部位以外的同 类或其它基团发生作用。 特点：修饰剂与底物具有相似的结构，对 酶活性部位具有高度的亲和性，能对活性部 位的氨基酸残基进行共价标记。 第五节 酶的化学交联修饰 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能 基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或