草鱼肠巨噬细胞分离培养和鉴定.PDFVIP

第42 卷 第 10 期 水 产 学 报 Vol. 42, No. 10 2018 年 10 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Oct., 2018 文章编号: 1000-0615(2018)10-1606-09 DOI: 10.11964/jfc.20170910950 草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定 陶会竹， 肖 宁， 赵雨婷， 房 慧， 李槿年* (安徽农业大学动物科技学院，兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽 合肥 230036) 摘要：为了建立草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法，本研究在采用刮除法结合胶原 酶IV消化法制备肠黏膜固有层单细胞悬液的基础上，使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒 分离肠巨噬细胞，再经差异贴壁法纯化肠巨噬细胞，最后，用含10%胎牛血清和5%草鱼 血清的RPMI 1640 完全培养液，在28 °C 、5% CO 条件下原代培养肠巨噬细胞，并通过细 2 胞形态学检查、分子标记检测和功能验证实验加以鉴定。结果显示，每尾鱼(约250 g)肠 7 巨噬细胞的获得量约为3×10 个，细胞活率为99.6% ，纯度达到95% 以上；倒置显微镜观 察发现，原代培养4~5 d 的贴壁细胞多呈圆形或多边形，体积明显增大，细胞汇合度达 到95% ；光镜和电镜观察到染色后的贴壁细胞具有巨噬细胞的形态结构特征，贴壁细胞 经荧光定量PCR在mRNA水平检测到巨噬细胞特异性标志分子(草鱼巨噬细胞集落刺激因 子受体) ，功能实验证实贴壁细胞具有吞噬功能，脂多糖能够显著提高其呼吸暴发活 性。本研究首次成功建立了草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法，为开展口服疫苗诱 导的草鱼肠黏膜免疫应答研究提供细胞模型。 关键词: 草鱼；肠巨噬细胞；分离；原代培养；鉴定 中图分类号: S 941.42 文献标志码: A 肠道既是硬骨鱼类的消化吸收器官，也是 物制剂，而口服疫苗是水产养殖中最适用的疫 其黏膜免疫器官。尽管鱼类肠道不具有哺乳动 [2] 苗类型 。草鱼肠巨噬细胞的活性与功能是评价 物的组织化淋巴器官(Peyer 氏淋巴集结及滤泡淋 口服疫苗诱导的草鱼免疫应答水平的指标，尤 巴结) ，但在肠道中后段黏膜层分布着大量巨噬 其是肠黏膜免疫水平的重要指标。由于巨噬细 细胞、淋巴细胞和粒细胞等免疫细胞，其中， 胞属不繁殖细胞群，在适宜条件下可存活 黏膜固有层肠巨噬细胞除具有吞噬、杀伤和清 2~3周，多用作原代培养，且原代培养细胞与体 除肠道病原微生物的功能外，还扮演着抗原递 内细胞的特性接近，能较真实地反映体内细胞 呈细胞的角色，发挥着启动和调节肠黏膜免疫 的活性与功能。因此，建立可操作性强、重复 [1] 应答的作用 。 性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化、原代培养 草鱼(Ctenopharyngodon