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第七节 电泳分离 电泳（electrophoresis, EP） ： 指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。 一、电泳的基本理论 1. 原理: 在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 2. 电泳的分类 自由界面电泳：又称移动界面电泳（moving boundary electrophoresis, MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:（zone electrophoresis, ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。 T= C= 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bis的质量比应在30左右。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。 优点： 分辨率高； 电泳时间延长，区带越来越窄； 样品可以加在电泳系统的任何部位； 浓度很低的样品也可以进行分离； 可用于准确测定蛋白质或其他两性电解质的等电点。 缺点： 电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀； 电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不适用。 载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在3～11之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。 电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。 正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。 根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，pI即是指溶液的pH值。 所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。 2）样品制备： a. PAGE: 样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝） b. SDS: 样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样及电泳： SDS: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。 4）固定及染色 a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙 酸（TCA）中固定蛋白质组分。 b.染色： 考马斯亮蓝染色法 银染法（灵敏度比前者高100倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。 四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。 原理