线粒体钙单向转运体对线粒体通透性转换孔的调控作用.pdfVIP

学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明…………………………………．31 引言 引言 近年来，随着人们生活水平的提高脑血管病的发病率越来越高，在相关疾病的 诊疗过程中，缺血再灌注损伤是重要的病理生理过程。1977年，Hearse首次提出缺 血再灌注损伤(Ischemiareperfusion 因缺血发生可逆性、可存活的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死 亡或进一步的功能障碍Ⅲ。脑是发生IR／I最常见的组织之一，其导致的迟发性神经 元损伤，严重影响患者的预后和功能恢复。脑缺血再灌注能触发一系列的复杂的级 联反映，包括线粒体功能障碍，ATP生成减少，Na+一K+泵功能障碍，Ca2+通道病理性 开放，导致细胞内钙超载、自由基产生、兴奋性氨基酸增加、N0缺失、激活内质网 应激反应等一系列病理事件，最终导致神经元细胞的变性和凋亡。在这一病理过程 中，线粒体的通透性转变起着重要的作用‘21。 线粒体是多种促细胞凋亡转导分子的靶点，也是细胞死亡通路的整合元件n1。 研究表明，线粒体的功能障碍和线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition ～般认为mPTP是由线粒体膜上多蛋白组成的非选择性复合孔道，其主要由外膜的电 压依赖性阴离子通道(VDAC)，内膜的腺苷酸转位子(ANT)，基质的亲环蛋白D 也参与了线粒体内膜间隙中蛋白的释放，在细胞凋亡和死亡中起到重要作用。ANT通 过改变线粒体的能量代谢作用于InPTP的开放。CyP-D是免疫抑制剂亲环素 (cyclos-porinA，CsA)在细胞内的结合蛋白，是一种与蛋白质合成后折叠和输送有 关的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)。其他构成部分可能主要起到调节作用¨一1。 mPTP的开放可发生在缺血再灌注的各个阶段，诱发mPTP开放的因素较多，胞浆 和线粒体基质Ca2+增加、自由基、神经酰胺和神经节苷脂、线粒体跨膜电位降低、能 1lr 细胞通过吸收Ca2+引起N0合酶(NOS)被激活，在线粒体内形成过氧化物，改变线粒 体膜的结构‘71。胞浆中的Ca2+是一种有效的诱导lIlPTP开放的诱导剂。超过生理剂量 p (≥10 子的效应。因此，增加游离Ca2+对诱导细胞凋亡十分重要‘81。 线粒体内膜上还存在着两种重要的Ca2+转运体，一种是线粒体钙单向转运体 】 引言 calcium (mitochondrial 介导线粒体基质中Ca2+的转运。然而研究表明，Na+／Ca2+交换体在缺血再灌注损伤中 作用很小，MCU在脑缺血再灌注损伤中发挥了重要的脑保护作用‘91。mPTP和MCU都介 导线粒体Ca2+转运体系且都与缺血／再灌注损伤(I／RI)有关，那么二者是否存在一定 的调节关系进而发挥保护作用，目前国内外的相关研究较少。因此，我们的研究设 计了检NMCU与mPTP之间的调控关系，以及探讨了这种调控关系在脑缺血再灌注损伤 中的作用。 本研究选取新生大鼠(出生24h内)为研究对象，采用原代培养大鼠海马神经元 的技术，利用荧光显微镜免疫荧光技术进行海马神经元纯度的鉴定；利用荧光分光 光度计进行了预处理组海马神经元细胞的抑制率检测：加入大剂量Ca2+，模拟缺血再 灌注过程，建立钙超载模型，利用激光共聚焦显微镜持续监测不同处理组线粒体内 calcein AM的荧光强度变化探讨了MCU对mPTP的调控作用。 2 第一章材料和方法 第一章材料和方法 1．1工具药 精胺(spermine，Sper)lg批号：$3256Sigma公司美国； A，CsA) C3662 环孢菌素(ciclosporin5mg批号： Sigma公司美国； 苍术甙(at