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过氧化物酶同工酶含量测定 实验原理 实验材料与器材 实验试剂 实验步骤 实验原理 考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blueG-250）测定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有一定差别。 实验材料与器材 （一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子） （二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管 实验试剂 1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。 2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。 实验步骤 （一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 表 绘制标准曲线各试剂加入量 (二) 样品的测定 取6支具塞刻度试管，分别加入实验一的4、7、8步中的样品(每一样品2平行样)0.1ml,各加用蒸馏水0.9ml，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，充分摇匀，放置2min左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，从标准曲线上查得样品中蛋白的含量。 结果计算 式中：C为标准曲线上查得样品中蛋白的含量，μg；VT为提取液的总体积，ml；WF为样品的鲜重，g；VS为样品测定体积，ml。 * * 100 80 60 40 20 0 标准蛋白质(μg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白质（ml） 6 5 4 3 2 1 管号
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