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PCR及其产物电泳分析 孙曙明 中南大学 生命科学学院 实验原理 PCR实际上是在体外模拟DNA体内复制的过程。和体内DNA复制一样，PCR在扩增DNA的时候也会经历DNA双链的解开（变性），寡聚核酸与单链DNA的结合（退火），以及DNA聚合酶开始合成DNA（延伸）的三个过程。但PCR和体内DNA复制不同，在体内DNA的复制整个过程是由一系列酶所控制的，所以像DNA解链等在体温下就可以完成。而PCR则需要一个高温来完成DNA的解链，所以PCR反应的DNA taq聚合酶是耐高温的酶。此外，无论体内或者PCR反应，DNA的合成都需要一小段寡聚核酸作为引物提供3‘羟基末端，以让DNA聚合酶识别并开始合成DNA。在体内这个3’羟基末端是由寡聚的RNA提供，而在PCR中则由寡聚的DNA提供，因为DNA分子比RNA分子稳定易于储藏和使用。在体内双链DNA聚合方向是5‘-3’的，其中一条链是5‘-3’，而另外一条链虽然也是5‘-3’，但它是由冈崎片段连接起来的，而总体的合成方向是3‘-5’。在PCR反应中，每一条链的合成方向都是5‘-3’，没有类似冈崎片段的东西。在体内，DNA聚合是从复制起始位点开始的，由聚合酶识别复制起始位点。而在PCR反应中，DNA的聚合是从引物结合处开始的，主要是由引物的特异性来控制复制的起始位置。 实验设备 实验反应体系 反应体系 ddH2O 36 uL 10×PCR反应缓冲液 5uL 2mmol/L dNTPs 5uL 上游引物 1uL 下游引物 1uL DNA模板 1uL Taq DNA聚合酶 1 uL 总体积：50uL 1.标记一个洁净的200uL反应管，向其中依次加入上述反应体系，混合均匀后，离心15s，使反应成份均匀富集于管底。2. 加石蜡油50～100μl于反应液表面以防蒸发。3.在PCR仪上设置反应循环参数，本次实验为：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循环数为30，最后于72℃充分延伸10 min后终止反应。4.置反应管于PCR仪上进行热循环。5. 反应完毕后，常取5～10％反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 实验步骤 注意事项 1.吸样量一定要准确； 2. 戴手套操作，避免污染； 3.要求在冰上操作，并充分混匀； 4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面， 以防污染。 结果分析 1. 是否有扩增产物 ； 2. 如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增； 3. 分子量标准电泳后区带是否分开； 4. 与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确； 5. PCR产物的产量。 PCR实验产物电泳结果示例 1. 无PCR产物。 常见的问题分析 2. PCR产物呈拖尾现象。 3.引物二聚体的出现。 4.阴性对照(不加模板DNA)有扩增带。 * 谢谢！