动物细胞培养技术..pptVIP

第十二章：动物细胞培养技术 第一节 体外培养动物细胞的生物学特征 第二节 动物细胞体外培养技术 第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定 第四节 细胞同步化 第五节 器官培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长，发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培养有很多优越性，但也有不足之处。 动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干扰素，生长调节素。 第一节体外培养动物细胞的生物学特征 一、体外培养物的细胞生物学特点 （一）生物学特征的两重性 1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互关系， 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相互关系 2、差异性 细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本机构和功能，也有不同于体内细胞的性状。 （二）培养细胞分化状态的改变 1、分化 在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分化。细胞经体外培养后，其原有的功能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件，把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧失。 2、去分化 去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋同性的过程。 二、体外培养细胞的形态 当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素的影响而发生改变。 （一）贴附型细胞和悬浮型细胞 1、贴附型细胞（见下图） 1） 成纤维细胞型 2 ）上皮细胞型 3 ）游走细胞型 4 ）多形细胞型 2、悬浮性细胞 悬浮性细胞 （二）细胞帖壁过程 对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。 支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。 （三）接触抑制和密度抑制 细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制 当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。 三、培养细胞的增殖能力 体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程称传代 （一）培养细胞生命期、 培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三个阶段。 1、原代培养基 原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。 2、传代期 初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止，进入衰退期。 3、衰退期 衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡 传代细胞由于目中因素的影响，可能发生自发转化，其标志是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍