第五章pcr法获取目五的基因.pptVIP

* PCR法获取目的基因 * （2）荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需电泳检测 * PCR法获取目的基因 * 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 * PCR法获取目的基因 * PCR相关的术语和产品层出不穷 T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green 五、PCR技术的应用 1.基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 * * PCR法获取目的基因 大肠杆菌 胰岛素 重组体 + 胰岛素基因 * * PCR法获取目的基因 2.遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 * * PCR法获取目的基因 PCR法获取目的基因 A 正常人 病 人 正常 病人 * * PCR-RFLP法： 限制性内切酶 3.恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 * * PCR法获取目的基因 突变 限制性内切酶 * * PCR法获取目的基因 正常 突变 电泳 * * PCR法获取目的基因 PCR法获取目的基因 4.基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 * * * PCR法获取目的基因 * 六、PCR法获取目的基因 1.T载体克隆PCR获取的目的基因 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因 * PCR法获取目的基因 * 具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作程序如下 方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5μl 10×Taq DNA Polymerase Buffer、4种dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Taq DNA Polymerase，加水至终反应体积为 50μl，72℃ 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆。 方案二 PCR 反应（50μl 反应体积）结束以后，加入1μl 20mM dATP 和2.5U 的Taq 酶，72℃ 保温10min ，然后进行直接进行TA克隆。 * PCR法获取目的基因 * 2.设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 目的基因的PCR片段 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体 经限制酶切割得到粘性末端 体外连接 获得目的基因的克隆 * PCR法获取目的基因 * /pcr.html /genetics/ward/tavi/PCR.html PCR的网上资源 * PCR法获取目的基因 * PCR引物设计 primer premier 实验技术——核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one 45 * * PCR法获取目的基因 * PCR法获取目的基因 * * PCR法获取目的基因 * 4.注意事项 PCR应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR实验空间。 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 PCR的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。 * PCR法获取目的基因 * 阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及