交换形成相关基因的rnai载体构建及转化甘官蓝型油菜研究-作物遗传育种专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．2．4 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．2．4 RNA提取和反转录 ．．19 2．2．5荧光定量PCR ．．21 2．2．6普通细胞学分析 ．21 3结果与分析 ．22 3．1干涉载体的构建 ．22 3．1．1目标干涉片段的选择 ．22 3．1．1目的片段扩增 ．23 3．1．2 PCR产物酶切、连接及转化大肠杆菌 23 3．1．3 RNAi载体酶切检测 ．25 3．1．4农杆菌菌落检测 ．26 3．2农杆菌介导的遗传转化 27 3．2．1甘蓝型油菜遗传转化与再生 ．27 3．2．2再生苗的生长 ．．28 3．3转基因植株分子生物学鉴定 30 3．3．1转基因植株PCR检测 ．30 3．3．1幼嫩花蕾的RNA提取与检测 31 3．3．2反转录与定量PCR检测 ．32 3．4转基因植株减数分裂染色体行为 34 4讨{仑 ．35 参考文献 ．37 附勇专 ．．46 致{射 ．．51 II 万方数据 交换形成相关基因的RNAi载体构建及转化甘蓝型油菜研究摘 交换形成相关基因的RNAi载体构建及转化甘蓝型油菜研究 摘 要 减数分裂中，同源染色体相互识别、配对后在非姊妹染色单体间发生片段交 换，导致同源重组的发生。同源重组是生物多样性产生的重要来源之一。近年来， 随着研究者对模式植物拟南芥、水稻减数分裂机制的深入研究，越来越多的参与 交换形成的基因被发掘，使得人工调控交换的发生及其频率成为可能，在作物遗 传育种中具有重要的潜在应用价值。甘蓝型油菜(Brassicanapus，AACC)为白 菜(丑rapa，AA)与甘蓝(B oleracea，cc)杂交形成的异源四倍体，是我国重要的 油料作物之一。由于缺少天然及人工突变体，对其减数分裂调控机制的研究鲜有 报道。本研究的主要目的是利用RNAi技术降低甘蓝型油菜中相关基因(均为拟 南芥减数分裂中参与交换形成的同源基因)的表达，分析甘蓝型油菜减数分裂中 交换形成的分子机制，并为通过同源／部分同源重组引入野生近缘种优异基因建 立材料基础。主要结果如下： 1)利用RT-PCRff增，从甘蓝型油菜Westar中获得FIGLl、MttFl、XRCC2、 ASYl和MUS81目标干涉区段。以质粒pFGC．5941为骨架，构建了上述五个基因的 RNAi载体，并通过酶切与测序验证。 2)利用农杆菌介导的遗传转化技术，以下胚轴为外植体，将上述载体分别 转入甘蓝型油菜Westar、J9709和JW76中，抗性筛选后共得到再生植株78株。 3)对其中66株进行PCI凇测，共鉴定到阳性植株48株，平均转化效率为 72．73％。其中带有FIGLl载体阳性植株25株，MHFl阳性株8株，艘CC2阳性株15 株。另外，获得MUS81转化再生苗12株，尚未鉴定；未获得ASrl转化植株。 4)根据各基因保守序列设计引物，通过qRT-PCR技术分析转基因阳性植株 花蕾中目标基因的表达情况。结果表明，在14株阳性植株中目标基因表达量不同 程度低于野生型材料。 5)与野生型相比，各阳性植株花粉母细胞减数分裂未发现明显异常。这与 拟南芥中上述基因的突变体表型相一致，这些突变体均具有正常减数分裂进程， 但同源染色体交换频率增加。 关键词：甘蓝型油菜；减数分裂：重组；交换；RNAi载体 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文Abstract 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 Abstract Recognition and pairing of homologous chromosome are essential to successful meiosis．frossogelS ale formed between non-sister chromatids of homologous chromosomes，which cause the recombination of homologous chromosomes． Recombination increase genetic diversity and provide a material basis for natural selection．In recent years，research of meiosis in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa show that there are rmny genes take part in the regulation ofcrossover,which make it possible for US to conlrol the forrmtion and frequency