肝酶的分离提取..pptxVIP

开题报告：肝酶的分离提取与纯化鉴定;内容;一、生物大分子的分离纯化方案;前期准备;1、分离生物大分子的一般步骤;材料的预处理——组织细胞破碎;生物大分子的精细分离;生物大分子含量的测定和纯化鉴定;二、设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶（该酶由三个不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线;实验思路;材料的选择;细胞破碎 细胞破碎可选用三种方法：机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法。本次使用机械破碎法中的匀浆法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 加入蛋白酶抑制剂：加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶的水解作用。常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） ;除核酸：一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。 离心：由于该酶的位置未知。故应用超速离心分离技术分离胞液中的酶体和微粒体，细胞核和线粒体。对三种成分分开研究，使得提取物中杂质减少。 超速离心分离技术的原理：细胞内不同结构的比重、大小和形态都不相同，在同一离心场中沉降速度不同。可根据这一原理，用差速离心法和密度梯度离心法将亚细胞组分分离。 ;酶的初步分离提取;盐析 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷和水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。且沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。 透析 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。透析法利用蛋白质和盐离子分子大小不同，盐离子 小能透过透析袋而蛋白质分子不能，由此可除去盐离子。 ;注意事项;步骤;3.初步分离提取 1）配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.2 2）将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静置一段时间 3）离心，去上清，留沉淀 ;4）加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液;酶的精细分离;本实验采用 离子交换层析法 纯化目的酶;DEAE-纤维素为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换剂。其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。;由于静电荷作用，在等电点时，两性离子不显电性 在pHpL的条件下带正电荷 在pHpL的条件下带负电荷; 再将乙酸铵缓冲液的pH值调到pH=6.1,此时pH=6.1的DEAE-纤维素可吸引pL6.1的蛋白，将pL6.1的蛋白质洗脱出来，并使pL6.1的蛋白留在溶液中，即得pI约为6.2的蛋白质。 每收集一管液体，取一滴滴至玻璃板上加20％磺基水杨酸试剂检验有无蛋白质流出，如有则成白色浑浊，将每个蛋白质组分峰所涉及的试管中蛋白质的溶液合并，则该峰为纯化的目的酶pH=6.2;实验步骤 DEAE-纤维素处理为PH值为6.3 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集最后一个峰的蛋白溶液 处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.1 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第一个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质 将两次收集蛋白质混合即为所得酶液;活性鉴定纯度鉴定; 1、 结合酶由酶蛋白和辅助因子两部分组成。辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度与作用特点不同可分为辅酶与辅基。辅酶与酶蛋白的结合疏松，可以用透析或超滤的方法除去。辅基则与酶蛋白结合紧密，不能通过透析或超滤将其除去。 酶的辅助因子多为复合有机或金属有机化合物，或金属离子。; 2、 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间