细胞器的分离-细胞器的分离.pptVIP

[目的要求] (1)初步掌握细胞器的分离原理及一般方法。 (2)学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法 实验二.细胞器的分离 [实验原理] 细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。 分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。 差速离心： 采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。  大颗粒首先沉到管底 较小颗粒沉降 速度区带分离法： 预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。 注：待分离颗粒密度比介质密度都要大： 不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部 [内容与方法] 内容： 大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离 方法： (3) 过滤： 将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取2ml的过滤液移入离心管中。 (2)匀浆: 每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,加入3ml的0.25mol/L蔗糖溶液进行匀浆。 (1)取材： 将饥饿24h的大白鼠处死。迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水，洗去血污，滤纸吸干。在小烧杯中剪碎，用少量0.25mo1/L蔗糖液洗涤数次。 (4)离心： 第一次: 1000rpm,8min。 (5)纯化： 在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心15min。 加0.25M蔗糖至4ml，混匀 第二次: 1300rpm,8min。弃上清 上清保留于试管1.0处 重复1次 （7）镜检：观察先用低倍镜。再用高倍镜 (6)细胞核鉴定： 。 涂片,空气干燥． 浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中20s，蒸馏水漂洗，擦干水分 固定： 染色： 悬浮： 在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀 线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清液以11400离心10分钟,弃去上清,沉淀用预冷0.25mol/l的蔗糖溶液悬浮至离心管1.0处,11400g离心10min,去上清。 鉴定:在干净的载玻片中央,用牙签挑取沉淀物均匀涂片.滴加2滴中性红-詹母绿染液染色15 min,盖上盖玻片,镜检.被染成亮绿色的即为线粒体. 1、染色时间要充分。 2、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。 注意事项 * haha * haha