姜黄素经由活化ros-ask1-jnk通路增效abt-737诱导肝阳癌细胞凋亡作用机制研究.docx

IIII IIII I Hl lLI IIq IIIllllllllll Illllll lll Y31 1 6434 博士学位论文 姜黄素经由活化ROS．ASKt．JNK通路增效 ABT-737诱导肝癌细胞凋亡作用机制研究 博士研究生：郑锐年 指导教师：汪森明 摘要 背景 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)为当今世界范围内严重危害人类 生命健康安全的常见恶性肿瘤之一，为全球第5位常见肿瘤，占癌症相关死亡 的第三位。目前，肝癌治疗仍以手术为主，但20．35％的肝癌患者适合手术治疗， 且术后复发率高，达50％。而肝动脉化疗栓塞(1、ACE)、局部消融治疗是非手 术切除原发性肝癌的首先治疗，但因治疗的不沏底性，其疗效也不尽如人意。 索拉非尼靶向治疗、FOLFOX4方案化疗是目前中晚期肝癌全身治疗一线选择， 但延长生存期有限。因此，寻找有效治疗肝癌的新途径是目前肿瘤医学界所面 临的巨大困难和挑战。Bcl．2、Bcl。xL以及Bcl．w是哺乳动物细胞内Bcl．2抗凋亡 蛋白家族中的重要成员。他们共同包含BHl、BH2、BH3和BH4等4个BH结 构域。据报道，Bcl．2抗凋亡蛋白能抑制线粒体外膜渗透性，从而抑制应激诱导 下细胞凋亡。多种肿瘤组织中常出现Bcl．2抗凋亡蛋白异常表达，同时，常伴随 着相关的治疗耐药。先前研究发现，Bcl．2抗凋亡蛋白的表达水平与与肝癌的临 床病理分级以及患者预后呈负相关。因此，抗Bcl．2抗凋亡蛋白靶向药物治疗有 望成为治疗肝癌的重要手段之一。ABT-737是由美国Abbot实验室所研发的一种 小分子Bcl．2、Bcl．xL以及Bcl．w抑制剂，目前，ABT．737正进行白血病患者的 I期临床研究。前期也有报道，ABT-737能抑制多种肝癌细胞生长。然而，ABT-737 在治疗肝癌细胞时常会同时激活其他抗凋亡信号通路，从而减弱ABT-737抗肿 万方数据 中文摘要瘤效应。因此，需寻找新的治疗策略来改善ABT-737抗肿瘤效应。姜黄素 中文摘要 瘤效应。因此，需寻找新的治疗策略来改善ABT-737抗肿瘤效应。姜黄素 (curcumin)是从中药姜黄中提取得到的天然色素成分。目前大量研究证实，姜 黄素对多种恶性肿瘤具有抗瘤效应，包括肝癌。多个前期研究表明，姜黄素能 有效抑制体内外肝癌细胞的生长。而且，姜黄素能明显增强常规化疗和靶向药 物的抗瘤效应。但是，姜黄素和ABT-737之间是否存在协同效应，目前仍未阐 述。 目的 本实验对姜黄素是否具有增强ABT-737抗HepG2肝癌细胞增殖作用进行研 究，同时，也对姜黄素是否通过诱导凋亡增强ABT-737抗HepG2肝癌细胞效应 进行研究，进一步，对姜黄素是否通过ROS．ASKl．JNK氧化还原信号转导通路 途径增强ABT-737诱导HepG2肝癌细胞凋亡进行探索。我们通过实验初步对姜 黄素增强ABT-737对HepG2肝癌细胞的抗肿瘤效应及其可能机制进行探索，旨 在为ABT-737以及姜黄素的进一步应用提供实验依据以及参考。 方法 (1)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3大组：@ABT-737浓度梯度组：分 别用0出、1州、5州、10州、15州浓度梯度作用于HEPG2细胞；②姜黄 素浓度梯度组：分别用0州、2 IxM、4 IxM、6斗M、8州浓度梯度作用于HEPG2 细胞；③联合用药组：选取姜黄素影响最小的浓度分别与0 IxM、l}lM、‘5出、 10 IxMABT-737联合作用于HEPG2细胞。用台盼蓝拒染实验检测各药物作用组 中人肝癌细胞HEPG2的死亡率；CCK-8实验检测各药物作用组中人肝癌细胞 HEPG2的增殖活性。 (2)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3组，即①I％DMSO溶剂对照组；② 单用药组：ABT-737 10州组和姜黄素2 gM组；③联合用药组：ABT-737 10州+ 姜黄素2 HM组。Hoechst 33258染色实验检测细胞凋亡情况；Caspase．3活性检 II 万方数据 博士学位论文测试剂盒检测各组细胞的Caspase．3活性；western 博士学位论文 测试剂盒检测各组细胞的Caspase．3活性；western blot法检测各组细胞中B—c1．2、 Mcl．1、PARP、C．PARP、C．caspase．3蛋白的表达；活性氧检测试剂盒检测各组 细胞中ROS水平。 (3)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3大组：第一组分为10 gMABT-737+2 州姜黄素组和10 gM ABT-737+2 gM姜黄素+10 gNAC组(ROS抑制剂)；第 二组分为10 lxM ABT-737+2 pM姜黄素组和10／xM ABT-737+2 p,M姜黄素+ SP600125组(烈K抑制剂)；第三组分