胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化三率的影响.pptVIP

胰腺干细胞与胰岛混合养对其转化率的影响 研究背景： 糖尿病（diabets mellitus,ＤＭ）是危害人类健康的重要疾病之一，胰岛移植已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途径。但胰岛移植使胰岛供体短缺的矛盾日渐突出，制约了其在糖尿病治疗领域的临床应用。因此，寻找可替代的其它来源的胰岛β细胞成为近年研究的热点，而干细胞诱导分化为胰岛细胞是最重要的研究方向之一如何诱导胰腺导管干细胞分化为可自身合成胰岛素的β前体细胞，目前尚无稳定的诱导方案目前，成体胰腺导管干细胞特性已得到证实，并已经通过诱导获得胰岛样结构 假说：胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率，其作用与细胞角蛋白-19（CK-19）的表达密切相关。 研究内容：分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组），胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞－胰岛混合培养组（Ⅲ组）。Ｖ型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后，使用FICOLL-400梯度离心法纯化胰岛；采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺导管干细胞进行培养，通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法，检测CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养，通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。 　实验材料与主要试剂　25mL 细胞培养瓶、24孔板,ficoll-400;β-巯基乙醇、Ｖ型胶原酶、HEPES、丫啶橙／碘化丙锭（AO/PI）、0.25%胰酶-EDTA（sigma）；RPMI1640培养基、低糖和高糖DMEM 培养基、胎牛血清（ FBS ）、牛血清白蛋白（BSA）、Trizol、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、尼克酰胺（Ｎ２）；兔抗大鼠巢蛋白抗体、山羊抗大鼠CK-19抗体、小鼠抗大鼠胰岛素抗体、小鼠抗大鼠胰高血糖素抗体;山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗山羊FITC荧光抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；双硫腙（DZT）为上海试剂三厂产品；RT-PCR试剂盒，大鼠胰岛素ELISA试剂盒（Ｒ＆Ｂ）。 方法：　1.实验分组　本实验共分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组），胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞－胰岛混合培养组（Ⅲ组）。各培养组细胞来源样本数均为２０个，各样本的细胞均来自不同的实验动物个体。 2. 　成年大鼠胰岛的分离、纯化与培养　取成年wistar大鼠，麻醉后取上腹部肋缘下横切口，丝线结扎胆总管入十二指肠处，胆总管内插管，逆行向胆总管内灌注0.8g/L的胶原酶-Ｖ10mL，分离胰腺置于１０ｍＬ胶原酶-Ｖ溶液中（ 0.8g/L ），38℃水浴静止消化17min取出后震荡15s，60目筛网筛过后加入含10%FBS的４℃Hank’s液终止消化，４℃，1000r/min离心2min，洗涤３遍。沉淀加入4mL25%的Ficoll溶液重悬，依次加入23%、20%、11%的Ficoll溶液，４℃、3000rpm离心20min。收集23% ～ 20%界面和20% ～ 11%界面的细胞悬液，并加入含10%FBS的４℃ Hank’s液，４℃、 1000rpm离心，洗涤３遍。手工挑拣直径大于100μｍ的胰岛，悬浮于有RPMI1640培养液（含105u/L 青霉素、100g/L 链霉素、20mmol/LHEPES,15%FBS）的24孔板中，每孔胰岛50个，37℃、5%CO2培养箱培养，隔日半量换液。 3. 　胰岛细胞产量、纯度和存活率计算以及生物学活性鉴定　① DTZ染色法计算产量及纯度；②AO/PI荧光染色计算存活率；③ 在培养的第1～13天，测定培养液中的胰岛素水平；④ 在胰岛培养的第3、5和10天，分别测定低糖及高糖刺激下的培养物胰岛素释放水平，同时计算胰岛刺激指数。 4. 　胰腺导管干细胞的体外分离、培养、鉴定与诱导分化　取孕14d的wistar大鼠腹中胎鼠的胰芽，胶原酶消化法取得原代细胞，置于含10% FBS的高糖DEME培养基中，待细胞生长铺满平底后以1:3传代，取第２代细胞行CK-19、巢蛋白、胰高血糖素和胰岛素免疫组织化学及RT-PCR检测。 相关检测证实细胞胰腺导管干细胞相关标志物阳性后，改用含10% FBS 、 b-FGF(20ug/L）、EGF(20ug/L）以及1%尼克酰胺的高糖DMEM 培养基进行诱导。 5. 胰岛与胰岛干细胞的混合培养　干细胞－胰岛混合培养组的干细胞在更换诱导培养基的同时向培养板中加入50个／孔手工分拣的胰岛（直径＞100um）。 6　胰腺导管干细胞的鉴定及其诱导分化率的比较 （1）ＲＴ-ＰＣＲ检测胰腺导管干细胞标志物基因的表达　Trizol提取诱导分化前的第２代胰腺导管干细胞总ＲＮＡ，按照逆转录