基因定位西与克隆.ppt

基因的定位与克隆 千奇百怪的突变体 获得突变体的方法： 1.1 自发突变 1.2 物理、化学诱变 1.3 插入突变法 ：T-DNA 插入法 ；转座子法 基因定位（mapping）：是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位置。 水稻中已克隆的重要基因 水稻白叶枯病抗性基因 Xa21 水稻分蘖控制基因 MOC1 水稻脆秆控制基因 BC1 水稻半矮秆基因SD1 水稻抽穗期基因 Hd1 水稻糊化温度控制基因 ALK 水稻抗稻瘟病基因Pi-b 一、连锁分析（Linkage analysis） 1）概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。 2）重组值（recombination fraction） 是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。（centimorgan，cM）交换值(RF)(%)=重组型的配子数/总配子数×100% 重组值越大，说明两基因间的距离越远，基因间的连锁强度越小；重组值越小，说明基因间的距离越近，基因间的连锁强度越大。 二、三点测交(three-point testcross)与染色体作图 为了进行基因定位，摩尔根和他的学生Sturtevant创造了三点测交方法，即将3个基因包括在同一次交配中。进行这种测交，一次实验就等于3次两点试验。 已知在果蝇中棘眼(ec)、截翅(ct)和横脉缺失(cv)这3个隐性突变基因都是X连锁的。把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体交配,得到3个基因的杂合体ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它们在X染色体的真实顺序)，取其中3杂合体雌蝇再与3隐性体ec ct cv/Y雄蝇测交，测交后代如下表。 结果分析 1、归类 2、确定正确的基因顺序 用双交换型与亲本类型相比较，发现改变了位置的那个基因一定是处于中央的位置，因为双交换的特点是旁侧基因的相对位置不变，仅中间的基因发生变动。于是可以断定这3 个基因正确排列顺序是ec cv ct。 三、图位克隆 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆，该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行（chromosome walking）逼近目的基因或通过染色体登陆（chromosome landing）（Tanksley et al.，1995）的方法最终找到包含目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。 图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况。 一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,即定位群体，如：F2、DH、BC、RI等。 二是开展以下几项工作：（1）首先找到与目的基因紧密连锁的分子标记；（2）用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体上的特定位置；（3）构建含有大插入片段的基因组文库；（BAC或YAC）；（4）以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；（5）用获得阳性克隆构建目的基因区域的重叠群；（6）通过染色体步行、登陆或跳跃获得带有目的基因的大片段克隆；（7）通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；（8）通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列 四、分子标记 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的种类 一、基于分子杂交技术的分子标记技术：限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)　 二、基于PCR技术的分子标记技术：①　随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )②　简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记 ：①　扩增片段长度多态性(Amplif