启动子克隆都方法研究进展.docVIP

PAGE PAGE 1 启动子克隆方法研究进展 随着 HYPERLINK /search.aspx?where=titlekeyword=%BB%F9%D2%F2cid=0sdate=2006-05-22edate=2007-05-23 \o 标题中含有基因的文章 基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=克隆 克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=克隆 克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=克隆 克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=克隆 克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1　启动子克隆的几种方法 1.1　利用启动子探针载体筛选启动子 　　启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离 HYPERLINK /search.aspx?where=titlekeyword=%BB%F9%D2%F2cid=0sdate=2006-05-22edate=2007-05-23 \o 标题中含有基因的文章 基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 　　利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告 HYPERLINK /search.aspx?where=titlekeyword=%BB%F9%D2%F2cid=0sdate=2006-05-22edate=2007-05-23 \o 标题中含有基因的文章 基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。 　　当插入段同时满足(1)具有 HYPERLINK /search.aspx?where=titlekeyword=%BB%F9%D2%F2cid=0sdate=2006-05-22edate=2007-05-23 \o 标题中含有基因的文章 基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 　　最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性 HYPERLINK /search.aspx?where=titlekeyword=%BB%F9%D2%F2cid=0sdate=2006-05-22edate=2007-05-23 \o 标题中含有基因的文章 基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了 HYPERLINK /Search.asp?Field=TitleClassID=keyword=酵母 酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet)和卡那霉素抗性基因(Kan)。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启