基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术.pptVIP

基因捕获(gene trapping)技术是一种产生大规模随机插入突变的便利手段，对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。 基因捕获技术的基本过程是：将一含报告基因的DNA载体随机插入基因组，产生内源基因失活突变，通过报告基因的表达，提示插入突变的存在，以及内源基因的表达特点。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库, 每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因，ES细胞克隆经囊胚注射发育为基因突变动物模型，通过对动物模型的表型分析鉴定突变基因的功能。 根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。 基因捕获技术可节省大量构建特异打靶载体，以及筛选染色体组文库的工作及费用，成为可同时对基因的序列、基因的表达以及基因的功能进行研究的高效技术。 随机突变筛选策略能够获得功能基因研究的新材料及人类遗传性疾病的新模型, 这种“表型驱动”的研究方式有可能成为功能基因组研究最有前景的手段和捷径。 基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验证，尤其是在生物体内从整体水平对基因功能进行研究，是鉴定基因功能的最终解决方案。采用不同技术建立的模式生物是研究基因功能必不可少的工具，各种方法都具有各自的特点和局限性。结合基因功能获得和失活技术，从正反两方面对基因。 小 结 CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单。以产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型TypeⅡ CRISPR/Cas 为例，其基因座结构可分别三部分，5’ 端为tracrRNA 基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因， 包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3’ 端为CRISPR 基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成。 3. TypeⅡ CRISPR/Cas 系统的结构及作用机理 crRNAs： CRISPR 位点的第一个重复序列上游有CRISPR 前导序列(Leader sequence),该前导序列可以作为启动子, 启动CRISPR 序列的转录。 多个研究表明CRISPR 基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成，被命名为CRISPRRNAs(crRNAs), 这些crRNA和Cas 蛋白共同参与 CRISPR 免疫防御过程 。 tracrRNA： 他们发现tracrRNA (trans-activating crRNA)对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA 的5’ 端与成熟的crRNA 3’ 端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA 与靶点的配对可能十分重要。其指导RNaseⅢ和Cas9 完成前体crRNA 的成熟，随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA 功能。 根据tracrRNA 与crRNA 的结构特性，他们将tracrRNA 和crRNA 表达为一条嵌合的向导RNA(guide RNA， gRNA)， 并在体外证明gRNA 可以发挥tracrRNA 和crRNA 的功能，在目的基因处切割,形成DSBs, 该过程是CRISPR/Cas 对基因组进行编辑的基础。 Cas9： 体外实验证明Cas9 基因是参与CRISPR 免疫系统的唯一必需基因, Cas9 是由1 409 个氨基酸组成的多结构域蛋白, 含有2 个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like 结构域及位于蛋白中间位置的HNH 核酸酶结构域, HNH 核酸酶结构域可以切割与crRNA 互补配对的模板链, 切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt 处,RuvC-like 结构域可以对另一条链进行切割, 切割位点位于PAM 上游3~8nt 处。在crRNA 与tracrRNA 形成的双链RNA 的指导下, Cas9 蛋白对靶位点进行切割。 此外，他们还证明，将RuvC 或是HNH 活性突变后Cas9 只有单链切割活性，类似于切口酶。 到目前为止, 虽然CRISPR/Cas 系统的详细作用机制尚未完全阐明, 但已基本明确了该作用机制的整个过程, 该过程大体分为3 个阶段： 1. 在噬菌体入侵的起始阶段, Cas 蛋白复合物靶向并裂解