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  凋亡检测 ——DNA LADDER—— 主 要 内 容 凋亡概述 凋亡检测方法的历史沿革 DNA Ladder 实验 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果 Apoptosis Necrosis Apoptosis (Kerr and Wyllie, 1972) Apoptosis ? A genetically programmed , non-necrotic cell death. Involved in tissue homeostasis, cell differentiation. Play major role in a variety of diseases(e.g. Alzheimer , AIDS , heart failure and cancer). 凋亡与坏死的差别 凋亡 坏死 胞体 变小 变大 胞膜 皱缩, 形成空泡 肿胀, 通透性改变 结局 形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞 崩解, 引起炎症反应 胞核 涉及多个细胞, 组织结 构被破坏 浓缩, DNA断裂成180～200bp或 其倍数的片段 与其他细 胞关系 不规则碎裂, 溶解 通常只影响散在单个细胞, 组织 结构不被破坏 Apoptotic Assay ?Morphology ?DNA Fragmentation ? DNA Ladder ?Caspase Activity ? Anti-PARP western blot ?Cell Membrane Alteration ?Phosphotidylserine Exposure Apoptotic Assay ?Morphology ?DNA Fragmentation ? DNA Ladder ?Caspase Activity ? Anti-PARP Western blot ?Cell Membrane Alteration ? Phosphotidylserine Exposure endonuclease Gel electrophoresis 700 520 360 180 Base pairs Distance between cuts = mutiple of 180 bps 180 bps Apoptotic DNA Ladder Lane 1: Marker Lane 2: negative control Lane 3: DNA of apoptotic cells Lane 4: DNA of necrosis cells 金标准 实验原理 细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活. 此酶可作用于连接DNA的核小体间区域, DNA链被切割成180~200bp或其整倍数的片断. 抽提DNA, 经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱 固定： 将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来，需要先固定。 方法： 1）物理固定，空气干燥， 冻结干燥。 2）化学固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。 实验步骤 获取凋亡细胞 抽提DNA 琼脂糖凝胶电泳 实验步骤 取16g大小的小白鼠, 外科手术取胸腺 少许洗去血迹 放入研磨器中(160目)研磨, 边磨边加1640液, 获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯, 加入120ml 1640液(一般一只小白鼠可获2x106/ml 细胞) 每孔加入1.2ml DEX(5mg/ml)混匀, co2培养箱, 370c, 5h 取1ml混悬液, 加入24孔培养板中 将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中, 3000r