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第五章 正常细胞的培养技术 正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难，因为它们是已分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前体外模拟的培养条件都还达不到与体内相一致的要求。正常细胞在体外并非不能培养，只要各种条件适当仍然有培养成功的可能，初代培养较传代细胞系容易。 正常细胞培养可用于许多方面，如研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响，作为 观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化），可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达，也可大量培养用于生物制品的生产，等等。 一、上皮细胞培养 上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层，其中来源于内外胚层的上皮细胞可呈膜状生长。不同器官的上皮细胞均具有不同的特定的功能，培养上皮细胞不仅有利于研究其功能，还可为烧伤、烫伤的皮肤进行上皮膜层移植，加速伤口愈合，不留疤痕，在皮肤美容方面也具有潜在的应用价值。 上皮细胞培养有三个难点： 需特殊底物 如需在底层涂以胶原或铺上饲养层细胞，以利于生长。 需特殊的培养液 如加浓缩维生素及氨基酸的EMEM及KGM（培养消化上皮细胞）、EGM（培养一般上皮细胞）等，价格昂贵。 与上皮细胞混杂的成纤维细胞的过度生长，常常干扰上皮细胞在体外的培养使其难以长期生存。 为此，需要从表皮分离、培养液和基质底物的选择、增加适当生长因子等方面着手，以抑制成纤维细胞生长，促进上皮细胞生长。由此可见，要纯化和延长上皮细胞生存期，抑制成纤维细胞生长或去除（或减少）成纤维细胞是上皮细胞培养成功的关键。 (一)表皮细胞分离与培养 皮肤是表皮细胞的重要来源，小儿阴茎包皮是表皮培养的好材料。目前，全皮培养混有大量成纤维细胞，因而不采用，常采用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。 （1）无菌条件下切取皮肤标本，以角化层薄者为佳，早产、流产胎儿皮肤更好。 （2）将皮块置于消化液中进行消化，此时表皮层与真皮层自然分离，表皮层为浅棕色，真皮层为白色。 （3）取出表皮层再进行第二次消化 。 （4）待充分消化后，剪碎移至瓶内加入适量培养液，吹打分散制成细胞悬液，用不锈钢纱网过滤，调整细胞浓度，用含15%胎牛血清的培养液进行分瓶培养，3天后可见大部分上皮细胞贴壁生长。 (二)乳腺上皮细胞分离培养 乳腺主要由腺上皮组成，早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集上皮细胞，培养时常用人胚小肠成纤维细胞作饲养层可抑制间质细胞生长。 (1) 取材， 于产后2~7天收集乳汁1:1的比例与培养基混合。 (2) 低速离心，仔细去除上清，收集细胞。 (3) 细胞洗涤后置于培养瓶中培养。 (4) 3~5天更换培养基，待细胞长满后可消化、传代 。 (5) 用乳腺细胞培养上皮细胞时，注意：①应尽可能去除脂肪组织，②如果标本中纤维组织较多，可用胶原酶消化法获取细胞，③初时有巨噬细胞存在，可作饲养层细胞，④培养时也可用经照射或用丝裂霉素C处理过的3T3细胞作饲养层细胞，或用胶原层，⑤培养液中也可加刺激生长因子如EGF、胰岛素、氢化可的松、猪促乳素和前列腺素E1等，有利于细胞生长繁殖。 表皮细胞生长融合成片，并向复层发展 表皮细胞贴壁生长，呈多边形，不规则 (三)子宫颈上皮细胞分离培养 子宫颈上皮细胞体外培养在细胞癌前病变及致癌的研究中有重要意义 。 常用组织块法进行原代培养，传代培养需用经照射或丝裂霉素C处理的3T3细胞作滋养层。培养液需添加适当的刺激生长的添加物。 （1）收集活检标本， 尽可能防止污染。 （2）洗涤、剪碎，去除纤维组织。 （3）37℃培养10天以上，组织块贴壁，加入EGF并用此培养液换液。 （4）消化、分散、传代培养。 (四) 肝细胞分离培养 可用组织块法和原位灌注消化法收获肝细胞进行原代培养，其形态规则，适于作多种功能的研究。 肝脏原位灌注消化法：从门静脉或其分支中插管，用无钙、镁PBS冲洗肝脏15分钟，然后用胶原酶液灌注15分钟，使纤维组织网被消化，经过2~3次离心分离，可获得大量肝细胞悬液。 培养时可将肝细胞接种在游离漂浮的胶原薄片上，细胞能较好地表达其功能 。 (五) 胰腺细胞分离 将获取的胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，经过3次离心分离收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集（2～24h），接种涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。 此法可用于家鼠和人胰腺细胞培养，培养时采用照射过的肺成纤维细胞作为饲养层，效果更佳。 (六) 气管及支气管上皮细胞分离培养 在血清存在条件下，正常人气管上皮细胞停止分裂和生长分化，因此需用无血清培养基(LHC-9),可使组织碎块的气管上皮细胞生长，并且抑制纤维细胞生长。 (七) 前列腺细胞培养 前列腺细胞的培