临床基因扩增检验被操作规范.pptVIP

临床基因扩增检验操作规范 ;一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 二、各阶段操作要求 三、PCR污染与对策 四、因操作欠规范导致的问题分析 ;一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能; 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 称扩增区）至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。; 各室功能： ;（一）试剂贮存和准备区; 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 ;（二）标本制备区; 要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。 ;（三）扩增区; 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。 ;（四）扩增产物分析区; 膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。 负压条件。 ;二、各阶段操作要求;（一）标本的采集;（二）标本的稳定化处理;（三）标本的运送;（四）标本的贮存;（五）标本的处理（核酸提取）; 操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴） 注意： ①离心管不能插得过低，以防进水； ②水浴时不能加盖，防管盖爆开； ③水浴时间须准确，10±1 min； ④水浴时不能走开； ⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。;（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增;RT-PCR操作注意：;（七）扩增产物的分析;实时荧光定量PCR;TaqMan荧光定量PCR原理; ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;三、PCR污染与对策;要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作： （一）污染的预防 （二）污染源的追踪 （三）污染源的处理 ;（一）污染的预防;3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。 4、检查结果的可重复性。;（二）污染源的追踪 ;1、阳、阴性对照;2、常见的环境污染源有 ;追踪可疑的环境污染源;（三）污染源的处理 ;1. 环境污染处理法;2. 反应液的污染处理法;(2) 内切酶法： 选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（M