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实验流程图 1 一：认识芽孢杆菌 芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌bacillus 杆菌科的一属细菌。 诱变方法 物理诱变 　　应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异 化学诱变 　　化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有：①烷化剂。这类物质含有1个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲烷（NEU）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸碱基类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。 淘汰野生型菌株的方法有 抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。 营养缺陷型的检出 点植对照法法 诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。 实验内容简介 本实验以芽孢杆菌为实验材料，通过诱变处理，本组采用紫外诱变处理，产生氨基酸营养缺陷性菌株，再通过抗生素法淘汰野生型菌种，用影印法检出缺陷性的菌株，并对缺陷性菌株进行鉴定 具体步骤及时间安排 第一周实验设计与准备，与小组成员进行讨论认真分析实验题目，确立实验方法，与步骤 第二周，按如下比例配置，但是用量整体降为原来的十分之一，即蒸馏水由1L降到100ml:1L 蒸馏水+20g 葡萄糖+15g 蛋白胨+5g 氯化钠+0.5g 牛肉膏+琼脂20克，或牛肉膏蛋白胨配 方法(1000ml)加 10g 的葡萄糖,调 ph 为 7 。灭菌后，将菌种接到培养基上培养。 1 第三周，本组实验为了不引入其他化学物质所以采用紫外诱变处理 ，首先将实验材料—芽孢杆菌配置成菌悬液。按如下比例配置，但是用量整体降为原来的十分之一，即蒸馏水由1L降到100ml: 1L 蒸馏水+20g 葡萄糖+15g 蛋白胨+5g 氯化钠+0.5g 牛肉膏，或牛肉膏蛋白胨配 方(1000ml)加 10g 的葡萄糖。 ph 为 7 即可。进行灭菌后，将培养的芽孢杆菌接种到液体培养基中，制成菌悬液。 将菌悬液置于紫外灯下进行照射 990S，然后进行遮光培养48小时。进行中间培养3代以上。 2 第四周，中间培养后，进行淘汰野生型操作。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。 具体操作，吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死） 4th day，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。缺陷型因不长避免被杀死）。 5th day，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3个时间段