基因改造非β细胞治疗ⅰ型糖尿病的实验研究-外科学专业论文.docxVIP

基因改造非p细胞治疗I型糖尿病的实验研究{ 基因改造非p细胞治疗I型糖尿病的实验研究 { 中文摘要 (卜、 关键词：胰岛素，I型糖尿病，基因治疗 磷酸烯醇我丙酮酸羧激酶，基因二[． 程 I型糖尿病是世界范围内以高血糖和酮症酸中毒等表现为特点的常见代 谢性疾病。近20年来我国糖尿病的发并率呈上升趋势，已成为继恶性肿瘤和 心脑血管疾患第三位重要的慢性非传染性疾病。因自身免疫反应破坏胰岛的B 细胞，患者多于青春期发病和依赖胰岛素的替代治疗，虽然这种治疗方法能使 病人恢复相对正常的生活，但仍存在不足之处并影响患者的生存质量。f比如， 长期低血糖导致肾、神经系统和视网膜等部位发生糖尿病特有的微血管病变。 所以胰腺或胰岛移植被人们用来重建糖尿病病人内源性胰岛素的分泌，希望能 取代外源性胰岛素注射治疗。然而供体不足、自身免疫反应、供体成活率低和 代价高等问题都限制这一方法的广泛应用。高发病率和I型糖尿病的病理生理 特征使其更适合应用基因治疗纠正胰岛素的不足，若采用基因工程的方法使自 身非B细胞分泌胰岛素，然后移植这些细胞治疗糖尿病可逃避针对B细胞的自 身免疫反应的攻击。不过，成功的胰岛素基因治疗必须符合以下要求：(1)有 效的胰岛素基因转移系统；(2)对葡萄糖浓度变化有正确反应能力的胰岛素基 因表达和分泌调节系统；(3)靶细胞具有将胰岛素原转化为成熟胰岛素的加工 系统；(4)具有与B细胞类似的生物学特性又不被自身免疫反应攻击的靶细胞。 为此我们在微囊化胰岛移植的实验基础上，应用分子生物学的方法建立具有胰 岛素调节性分泌的人工B细胞株，探索取代胰岛或胰腺移植治疗糖尿病的新方 法。V ／ 胰岛素基因在非B细胞中表达成熟胰岛素的研究 目的是为了研究在非B细胞中表达成熟胰岛素，探索替代胰岛素注射或胰 岛移植治疗I型糖尿病的方法。采用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by OVeFlap extention，gene SOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的 cDNA，并于c肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点 Arg—Xaa．Lys／Arg．Arg，将获得的突变体重组表达载体PcDNA3．1／C，通过脂质 体法转染体外培养的Hela，293，和L02细胞，G418筛选阳性克隆。同时用放 沈坤堂博：L论文射免疫、免疫荧光和高压液相色谱(HPLC)的方法监测细胞内外胰岛素的表达水 沈坤堂博：L论文 射免疫、免疫荧光和高压液相色谱(HPLC)的方法监测细胞内外胰岛素的表达水 平。f结果成功地对胰岛素原oDNA的三个位点进行了突变，空载体转染的细胞 无胰岛素表达。而在转染突变后胰岛素原基因eDNA的细胞培养液中胰岛索的 表达量各不相同： 8．45～188．00uIU／2．0×106Hela cellS·d～， 159．88～ 242．14uIU／2．0×106 293 cel lS．d；筛选出的L02各细胞株的表达量为2．56～ 61．95uIU／2．0×106 cellS·d～；免疫荧光显示细胞浆内有囊泡状分泌颗粒；而 且HPLC进一步证实细胞表达的胰岛素主要以成熟胰岛素的形式存在于培养液 中。实验表明突变的胰岛素原eDNA能成功转梁非胰岛B细胞并表达胰岛索， 为开展糖尿病的基因治疗研究奠定了基础。、|f ? 强力霉素可调控性的人工B细胞株的建立 人工B细胞株能为I型糖尿病的治疗提供丰富的细胞来源，但在生理情况 下胰岛素的分泌需受到严格的调控。四环素表达系统是一种‘基因开关”，可 以通过加入外源性刺激物，如强力霉素(Dox)来诱导基因的表达×所以我们应 用这一系统，建立条件控制性人工B细胞株，定量调节胰岛素基因在293细胞 中的表达。首先，用PCR方法自质粒pcDNA3．1／C．raINS获得突变的人胰岛素 原cDNA，并将其插入表达载体pTRE2启动子的下游，构建重组载体 pTRE2mINS。因这种启动子由四环素反应元件和CMV最小启动子组成，所以 当Dox存在下，可以被反义四环素激活因子激活。再将此载体与具有潮霉素抗 性的质粒pTK．Hyg共转染能稳定表达反义四环素激活因子的细胞株Tet293， 然后经潮霉素(30ug／m1)筛选表达胰岛素的细胞株，通过Dox调节胰岛素在此细 胞株中的表达。采用Northern blot、RT-PCR和放射免疫分析法，从mRNA和 蛋白水平观察细胞培养基中强力霉素浓度的变化对胰岛素基因表达的影响。 然后从28个单克隆细胞株中挑选一株能自主分泌一定量的胰岛素，又能 受Dox调控分泌的细胞株(tet293／Ins6)。当细胞培养液中Dox浓度增加时(0， 10，100，200，400，800，100099．L’1)，培养基中胰岛素的表达量由9．7pU ．d～．cell。增加到241．0