基因治疗促进皮瓣血运重建的实验研究-整形外科专业论文.docxVIP

叶T闲协和医f}人学博Ij研究生学位论史 叶T闲协和医f}人学博Ij研究生学位论史 毕㈨治疗促i挂戍瓣m运蕺建的实验州究 基因治疗促进皮瓣血运重建的实验研究 摘 要 l基因治疗是二十世纪九十年代以后才逐渐发展起来的一种全新的治疗手段，与 传统韵利用蛋白质类药物不同，它是将外源性核酸等遗传物质导入人体，利用其矫正 特定基因的缺陷或调节某种蛋白的表达，来达到治疗某种疾病的目的。目前基因治疗 的实验研究几乎涉及到医学的各个领域，尤其在遗传性疾病、癌症、心血管疾病治疗 等方面，取得了令人振奋的成果，但在创伤治疗、组织移植领域这方面的研究尚少。 VEGF基因是心血管性疾病基因治疗实验选用最多的目的基因，实验证实外源基因转 染心肌、骨骼肌后能够促进局部血管的增生，而血管增生、血运重建也是创伤愈合、 组织移植过程中所关心的问题j本实验的目的正是借助于皮瓣，探索VEGF基因治疗 在组织移植领域的应用。 ，本实验利用PCR技术，自人胎肝cDNA库中钓取VEGFl65基因片段，将之连 接j越撅粒pUCl9中，在工程菌E．coli DH5 Q中进行扩增，纯化后进行DNA测序，筛 选出序列正确的单克隆。选用质粒pcDNA3．1／zeo(+)作为真核细胞表达载体，将经测 序证实序列正确的VEGFl65 eDNA片段进行体外重组，重组质粒在工程菌E．coli DH5 n中大量扩增，QIAGEN去内毒素质粒提取纯化试剂盒行质粒的大量提取。重组 质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导下转染体外培养的哺乳动物细胞293， 分别收集转染后24小时、48小时、72小时的细胞和培养液，行SDS一聚丙烯酰胺凝 胶蛋白电泳，硝酸银染色及Westem blotting检测VEGF的瞬时表达情况。将 pcDNA3．1／zeo(+)一VEGFl65与阳离子脂质体Lipofectamine 2000按一定比例混合，注 射到Sprague—Dawley(SD)大鼠背部皮下，定期切取注射区域皮肤及皮下组织标本，行 免疫组化检查，以直观显示VEGFl65的表达情况，常规HE染色，观察皮下血管的 密度及毛细血管增生状态，并以测微器行皮下组织血管计数，了解局部血管的变化趋 势。以小型猪为实验动物，建立猪背部随意皮瓣模型，每侧掀起3个4cmxl6cm的蒂 在上的随意皮瓣，右侧的3个皮瓣作为实验组，皮瓣皮下注射重组质粒与脂质体的混 合物，左侧的3个皮瓣作为对照组，注射相同体积的生理盐水，术后第10天，测量 皮瓣的成活长度，观察两组之间的差异，SPSS对之进行统计分析。， 实验结果显示：选用合适的引物及退火温度，可以在人胎肝eDNA库巾克隆出 VEGFl65 cDNA片段，它含有完整的开放阅读框。由此而构建的重组质粒表达载体 系统peDNA3．1／ZeO(+)-VEGFl65在体外表达实验中，Western blotting检测到特异性条 带，说明该系统能正常工作。 在动物实验中，大鼠皮下注射重组质粒与脂质体的混合物，术后1日，应用抗 人．VEGFl65单克隆抗体行免疫组化检查，即可检测到人VEGFl65的存在，而以术 后一周内最明显，可以持续到术后20日；与之相对应的是皮下组织中新生血管增多， 闻协和医科人学博11研究生学位论文 闻协和医科人学博11研究生学位论文 堆㈨治疗促进皮瓣恤运取建的实验研究 针对Ⅷ因子通过免疫组化对血管内皮细胞作特异性染色，显示出皿管内皮细胞增赡， 皮下组织中存在大量的山单层内皮细胞围成的d,glt管：血管增生在术后3同出现一个 高峰，此后逐渐下降，但与对照组相比较仍维持在一个较高水平；术后14同血管增 生趋于稳定，血管逐渐成熟，没有在局部出现血管的过度增髓，即类似于血管瘤样的 改变：接受基因注射的大鼠，其肝、肾组织的病理检查与对照相比，没有发现形态结 构的改变，局部无血管增生。 在猪背部随意皮瓣模型中，术后第10天，皮瓣成活区与坏死区界限明显，皮下 注射pcDNA3．1／zeo(+)一VEGFl65的实验组，皮瓣平均成活长度较对照组增加，分别 为10．27士1．5lcm和8．叭士O．56 cm(p0．01)，试验组皮瓣最长可成活13．5cm，对照组 为9．0cm。、 结论：外源VEGF基因导入体内，能够在一段时间内持续表达VEGF，并发挥 其促进血管增生的生物学效应，可以用于重建血运、增加局部血流量的目的，提高皮 瓣活力。其在皮瓣、骨组织、神经、肌腱、脂肪、肌肉等组织的游离移植，以及创伤 愈合等方面也都具有良好的应用前景。 直接皮下注射，重组质粒能在注射部位较好的表达目的基因，操作简便、灵活， 对于皮瓣移植来说，是一种理想的基因治疗途径。 以质粒为载体，通过阳离子脂质体介导的VEGFl65基因转染后，没有造成局 部血