基因转染饲养细胞对造血干祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究-免疫学专业论文.docxVIP

苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、 中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在年二月解密后适用本规定。 非涉密论文回 论文作者签名： 固塑塑E 日 期：艘!!：垒：兰I_ 导师签名： / bt 基因转染饲养细胞对造血干，祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究 基因转染饲养细胞对造血干，祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究 中文摘要 中文摘要 目的： 比较人白血病抑制因子(hLIF)的不同添加方式对脐血造血干／祖细胞体外增 殖过程中自我更新和归巢潜能的影响，并研究hLIF对JAK／STAT信号通路的激活 作用及其在维持造血干细胞增殖和自我更新过程中的分子机制。 方法： 1．将本科室构建成功并鉴定正确的重组腺病毒载体Ad．hLIF和Ad．GFP体外感 染WI．38细胞(一组为重组腺病毒直接感染WI．38细胞，另一组为先将WI．38细 胞接种于丝素膜上；再用腺病毒感染)，经RT-PCR、ELISA法检测hLIF在饲养层 细胞中的表达。 2．将Ad．hLIF及Ad．GFP等感染的WI。38细胞作为脐血造血干／祖细胞体外培 养的饲养层细胞(或直接添加l止IF)，并以细胞因子等组作为对照，体外培养7d 后，通过流式细胞仪检测法和Transwell法，比较各组干细胞体外培养后细胞表面 黏附分子的表达变化，以判断细胞的分化及归巢潜能，并培养30d后观测各组细 胞的扩增情况。 3．在基因转染饲养层组、空载体组和细胞因子组共培养体系中中加入 JAK／STAT信号通路的特异性阻断剂AG490，并设无阻断剂的对照组，共培养7d 后流式细胞术检测表面黏附分子的表达量，Transwell法检测干细胞的归巢能力。 4．RT-PCR法和免疫细胞化学法检测各实验组和对照组细胞中STAT3的转录和 表达。 5．Western blot法检测各培养体系干细胞中p-STAT3和活化的蛋白激酶 p-JAKl、p-JAK2的表达变化，做28d的长期培养后进行细胞计数，绘制细胞生长 曲线，并在不同时间点流式细胞术检测CD34十的比例，比较阻断前后干细胞自我 更新能力的维持。 结果： 1．用RT-PCR、ELISA法检测到转染Ad．hLIF的WI。38饲养层细胞中有hLIF 中文摘要 中文摘要 基因转染饲养细胞对造血干，祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究 基因的转录和表达； 2．造血干／祖细胞直接加在饲养层上面和饲养层细胞悬浮于干细胞培养体系中 均能对造血干细胞的体外扩增和自我更新发挥重要作用，两者之间没有显著差异， 直接添加hLIF的方式对干细胞体外扩增和自我更新能力的维持作用显著低于前两 种添加方式； 3．加入JAK／STAT信号通路的阻断剂后，干细胞表面黏附分子的表达和体外归 巢能力均降低，RT-PCR法和免疫细胞化学法检测到加入阻断剂前后干细胞中 STAT3的转录和表达没有明显变化； 4．Western blot法检测到加入阻断剂后干细胞中STAT3和蛋白酪氨酸激酶 JAKl、JAK2的活化明显受到抑制，并且加入阻断剂后干细胞增长速度明显变慢， 相同时间点加入阻断剂培养的干细胞CD34+比例低于未添加组，两者间的差异有 统计学意义。。 结论： 1．干细胞直接加于饲养层细胞上或饲养层细胞悬浮于干细胞培养体系中均对 造血干细胞体外扩增和维持自我更新发挥重要作用，两者间无显著差异； 2．饲养层细胞分泌hLIF的添加方式明显优于直接添加细胞因子hLIF； 3．饲养层分泌的hLIF可以成功激活JAK／STAT信号通路，并通过此信号通路 影响造血干细胞的自我更新及归巢相关功能。 关键词：人白血病抑制因子(hL腰)；造血干／祖细胞；自我更新；信号通路 作 者：田丽娜 指导教师：缪竞诚(教授) 基因转染饲养细胞对造血干，祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究 基因转染饲养细胞对造血干，祖细胞体外增殖和自我更新的影响及分子机制的研究 英文摘要 The effect of gene transfected feeder layer cell to hematopoietic stem／progenitor cells on its pr